李天芝，于新友，李書光,2，苗立中,2，沈志強,2*

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600 2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

基于gyrB基因的地衣芽孢桿菌PCR快速檢測方法的建立

李天芝1，于新友1，李書光1,2，苗立中1,2，沈志強1,2*

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600 2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

根據(jù)地衣芽孢桿菌的gyrB基因序列設(shè)計一對引物，擴增片段大小為507 bp的基因片段，該方法對地衣芽孢桿菌DNA的擴增結(jié)果為陽性，對照菌株擴增結(jié)果均為陰性，對地衣芽孢桿菌檢測的靈敏性為1 pg總DNA量，成功建立了地衣芽孢桿菌PCR檢測方法，該方法具有快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，為地衣芽孢桿菌的分離及鑒定奠定了良好的基礎(chǔ)。

地衣芽孢桿菌；gyrB基因；PCR

地衣芽孢桿菌對葡萄球菌、酵母樣菌等致病菌有頡頏作用，而對雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、消化性鏈球菌有促進生長作用，從而可通過調(diào)整菌群失調(diào)達到治療目的，還可促使機體產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)、殺滅致病菌。此外，地衣芽孢桿菌還可通過奪氧生物效應使腸道內(nèi)缺氧，有利于大量厭氧菌生長，造成腸道低氧環(huán)境，對腸道內(nèi)的雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、消化鏈球菌等有益健康的厭氧菌生長繁殖有促進作用，對葡萄球菌、白色念球菌、酵母樣菌等致病菌則有頡頏作用。通過這種雙重作用可以調(diào)整腸道菌群失調(diào)，維持機體腸道微生態(tài)平衡，從而對腸道疾病達到治療和預防的目的。普遍存在于細菌中的單拷貝gyrB基因，是編碼促旋酶B亞單位的基因。gyrB基因能不斷進化，替換0.7%～0.8%的堿基大約需要的時間是100萬年，可作為細菌鑒定的一種靶基因，這一點已經(jīng)得到專家學者的認可[1-2]。目前，gyrB基因已經(jīng)廣泛應用于多種細菌種屬的快速鑒定，如巴氏肺炎球菌、芽孢桿菌屬、苯酚分解菌和蛭弧菌屬[3]。本試驗參照地衣芽孢桿菌gyrB基因序列，設(shè)計1對引物，對PCR反應條件進行優(yōu)化，建立地衣芽孢桿菌的PCR快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑和試劑盒

地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、弗氏弧菌均由山東綠都生物科技有限公司實驗室保存，馬丁肉湯培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司，Taq DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司，細菌基因組DNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 PCR引物設(shè)計和合成

參照Genbank登錄的地衣芽孢桿菌gyrB基因序列（DQ309295），用Primer primer 5.0軟件分析后，設(shè)計1對引物，gyrB-F：5'-GCCGGCTTCATGGG TTCCG-3'，gyrB-R:5'-GCGTCGGTGCTTCTGTTG-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 PCR模板制備

將地衣芽孢桿菌接種于馬丁肉湯，37℃培養(yǎng)18～20 h，離心沉淀菌體用磷酸鹽緩沖液離心洗滌2次后，提取其基因組DNA，按照百泰克細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提供的方法進行操作，同時提取其他幾種對照菌的DNA作為模板。

1.4 PCR反應體系和條件的優(yōu)化

PCR反應體系：10×緩沖液2.5 μL，dNTP 2 μL，引物上、下游各1 μL，DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O補至25 μL。然后對退火溫度進行優(yōu)化（48～58℃梯度溫度，每2℃為1個梯度），最后確定反應程序為：95℃5 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，從94℃開始30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.5 PCR產(chǎn)物電泳檢測和測序分析

取PCR產(chǎn)物5 μL，用瓊脂糖凝膠1.2%電泳進行檢測，回收目的基因，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，將經(jīng)PCR鑒定陽性菌落，搖菌，提取質(zhì)粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序鑒定，并將測出的序列與GenBank中參照的的地衣芽孢桿菌gyrB基因序列進行相似性比較。

1.6 特異性檢測

分別提取地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、弗氏弧菌等6種細菌的基因組DNA作為模板，用已建立的方法進行擴增。

1.7 敏感性檢測

用核酸濃度測定儀測定制備的地衣芽孢桿菌基因組DNA的濃度后，10倍系列稀釋DNA，使其分別相當于含有DNA 10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、0.1 pg，分別作為模板，做PCR擴增，檢驗檢測方法的敏感性。

1.8 重復性檢驗

用建立的PCR檢測方法，對地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、弗氏弧菌的DNA，重復檢測3次，以驗證本方法的重復性和穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物的檢測和序列鑒定

用1.2%瓊脂糖凝膠電泳方法檢測PCR擴增產(chǎn)物，結(jié)果在507 bp出現(xiàn)一條特異性條帶，見圖1。

圖1 地衣芽孢桿菌PCR擴增結(jié)果

將PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體后，進行測序，測得的序列如下：

將該序列與GenBank登錄地衣芽孢桿菌（登錄號：DQ309295）的序列進行比對分析，結(jié)果表明，兩序列的相似性為100%。

2.2 特異性檢測

PCR擴增結(jié)果表明，只有地衣芽孢桿菌出現(xiàn)了507 bp的擴增條帶（預期大小為507 bp），對照菌的PCR擴增均無條帶。因此，該引物對地衣芽孢桿菌具有較強的特異性，特異性試驗見圖2。

圖2 特異性試驗

2.3 敏感性檢測

分別取PCR擴增產(chǎn)物5 μL，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由檢測結(jié)果可知，該PCR方法最低可檢測1 pg地衣芽孢桿菌基因組DNA的量，敏感性檢測見圖3。

圖3 敏感性試驗

2.4 重復性檢驗

3次重復性的試驗結(jié)果均無差別，表明建立的檢測方法穩(wěn)定且具有良好的可重復性。

3 討論

傳統(tǒng)的地衣芽孢桿菌實驗室檢測方法（病原分離與生化鑒定等）操作復雜，耗時長，也可用多位點可變分析法、real-time PCR等進行檢測[4-5]。然而這些檢測方法相對普通PCR有較高的要求，需要特殊的儀器設(shè)備，不能滿足基層工作者對地衣芽孢桿菌的快速檢測鑒定的需求。李宏等根據(jù)地衣芽孢桿菌的gyrB基因序列設(shè)計了1對特異性引物，擴增產(chǎn)物大小為303 bp，以此引物對為基礎(chǔ)，成功建立了靈敏度為1×10-3mg·L－1的地衣芽孢桿菌PCR檢測方法[6]。

本試驗參照Genbank中登錄的地衣芽孢桿菌gyrB基因，對序列進行分析，設(shè)計1對引物，對地衣芽孢桿菌PCR檢測方法進行優(yōu)化，分別采用48、50、52、54、56、58℃等6個不同的退火溫度，得到PCR擴增反應最佳的退火溫度是54℃，該法只對地衣芽孢桿菌的核酸有特異性擴增條帶，對枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、弗氏弧菌的擴增結(jié)果均為陰性，該PCR檢測地衣芽孢桿菌靈敏度可以達到1 pg DNA。試驗結(jié)果表明，該檢測方法操作簡便，敏感性高，實用性強，且有較高的特異性，能快速從多種細菌中鑒定出地衣芽孢桿菌。

[1] Fukushima M,Kakinuma K,Hayashi H,et al.Detection and identification of Mycobacterium species isolates by DNA microarray [J].Journal of Clinical Microbiology,2003,41（6）:2 605-2 615.

[2] 李獻梅,王小芬,楊洪巖,等.促旋酶（gyrase）B亞單位基因gyrB在鑒別細菌近緣種中的應用[J].微生物學報,2008,48（5）: 701-706.

[3] 侯曉麗,陳智.分類及鑒別細菌的新靶標—gyrB基因[J].國外醫(yī)學·流行病學傳染病學分冊,2005,32（2）:38-41.

[4] Dhakal R,Chauhan K,Seale R B,et al.Genotyping of dairy Bacillus licheniformis isolates by high resolution melt analysis of multiple variable number tandem repeat loci[J].Food Microbiology, 2013,34（2）:344-351.

[5] De Clerck E,Vanmol K,Jannes G,et al.Design of a 5,exonuclease-based real-time PCR assay for simultaneous detection of Bacillus licheniformis,members of the'B.cereus group'and B.fumarioli in gelatine[J].Letters in Applied Microbiology,2004,39 （1）:109-115.

[6] 李宏,吳海武,孟凡同,等.基于gyrB基因的地衣芽孢桿菌PCR快速檢測方法的建立[J].海南大學學報:自然科學版, 2013,31（3）:230-233.

Development of A PCR Method for Rapid Detection of Bacillus LicheniformisBased ongyrBGene

LI Tianzhi1,YU Xinyou1,LI Shuguang1,2,MIAO Lizhong1,2,SHEN Zhiqiang1,2*

（1.Shandong Green Biological Technology Co.,Ltd.,Binzhou 256600,Shandong China;
2.Shandong Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600,Shandong China）

In this study,based on gyrB gene sequences from Bacillus licheniformis,a pair of specific primers was designed.The size of the amplified product were 507 bp.The amplified results from Bacillus DNA were positive,but the results were negative from control strain.The sensitivity for Bacillus licheniformis was 1pg DNA.A PCR method for detection of Bacillus licheniformis was established.The method had the advantages of high-efficiency, high-sensitivity and high-specificity,and which set a good foundation for isolating Bacillus licheniformis from a complex microbial community samples．

Bacillus licheniformis;gyrB gene;PCR

S917.1

A

1001-0084（2015）03-0029-03

2015-01-23

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-06-011-14)

李天芝（1985-），女，山東菏澤人，碩士，助理研究員，主要從事動物傳染病診斷技術(shù)研究。