摘要：目的 對(duì)比實(shí)時(shí)定量PCR法與抗原檢測法檢測全血樣品巨細(xì)胞病毒（CMV）感染的差異。方法 采自79例患者的479份全血樣本，分別應(yīng)用CMV DNA PCR法和CMV抗原檢測法進(jìn)行測試，結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。其中13例患者應(yīng)用更昔洛韋進(jìn)行抗病毒治療，在治療前后反復(fù)采血，對(duì)比兩種檢測方法在治療監(jiān)測方面的差異。結(jié)果 13例抗病毒治療患者中，PCR法可更早檢測到病毒感染，治療后PCR法病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間長于CMV抗原檢測法。結(jié)論 全血樣本CMV DNA PCR法檢測，敏感度較高，是一種檢測CMV感染的有效工具。

關(guān)鍵詞：巨細(xì)胞病毒；實(shí)時(shí)定量PCR；抗原檢測試驗(yàn)

Real Time Quantitative PCR Method and the Comparison of the Detection of Cytomegalovirus Infection by the Traditional Method

SHI Xiao-ying，LI Min-lu，HUANG Wei，DENG Chun-fa

（Dongxihu District Center for Disease Control and Prevention，Wuhan 430040，Hubei，China）

Abstract：Objective To compare the efficacy of use of real-time PCR for quantitation of Cytomegalovirus（CMV）DNA in whole blood with the antigenemia assay. Methods 479 whole blood samples from 79 patients， falling under different disease groups， were tested by real-time CMV DNA PCR using the Q-CMV real-time complete kit and CMV antigenemia assay， and the results were compared. Repeatedly tested patients were selected and their charts were reviewed for ganciclovir therapy. Results The 13 patients were transplant recipients and treated with ganciclovir. Before treatment， CMV was detected earlier by real-time CMV DNA PCR than the antigenemia assay. After treatment， the antigenemia assay achieved negative results earlier than real-time CMV DNA PCR. Conclusion Q-CMV real-time complete kit is a useful tool for early detection of CMV infection in whole blood samples .

Key words：Cytomegalovirus； Real-time quantitative PCR； Antigen detection test

巨細(xì)胞病毒（CMV）主要發(fā)生于實(shí)質(zhì)器官抑制和骨髓移植的患者中，直接影響器官移植的效果，因此早期診斷治療CMV感染意義重大[1]。目前用于診斷CMV感染的技術(shù)包括：病毒培養(yǎng)、抗原檢測、雜交試驗(yàn)、定量或半定量PCR檢測等[2]。CMV pp65抗原檢測是一種免疫熒光試驗(yàn)，通過間接免疫熒光技術(shù)鑒別外周血白細(xì)胞表面的pp65蛋白，這種蛋白常于CMV感染后表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測CMA DNA的優(yōu)點(diǎn)在于較高的敏感度和簡單的操作流程[3]。Q-CMV 實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒 （Nanogen公司）是與CMV抗原檢測試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比，通過分析不同人群的試驗(yàn)結(jié)果，探討應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測全血CMV DNA在臨床檢測中的特點(diǎn)。

1資料與方法

1.1一般資料 對(duì)2012年～2014來我院檢查的79例患者進(jìn)行回顧性研究。在反復(fù)檢測的患者中，回顧更昔洛韋抗病毒治療的有效性。EDTA抗凝靜脈血樣本被收集，應(yīng)用于抗原檢測試驗(yàn)和實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)。

1.2 CMV pp65抗原試驗(yàn) 在樣本收集4h內(nèi)進(jìn)行抗pp65原檢測試驗(yàn)，應(yīng)用CINA試劑盒系統(tǒng)（ArgeneBiosoft公司，法國）。全血細(xì)胞離心涂片，細(xì)胞量控制在2×105個(gè)/玻片，常規(guī)固定、透膜。按照試劑盒流程，應(yīng)用CMV pp65 單克隆抗體檢測 CMV pp65 抗原的表達(dá)，應(yīng)用熒光二抗進(jìn)行檢測。

1.3全血CMV DNA 實(shí)時(shí)定量PCR檢測 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測CMV DNA與CMV抗原檢測同步進(jìn)行，應(yīng)用Q-CMV實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，按照試劑盒操作規(guī)程實(shí)施。試劑盒主要通過擴(kuò)增CMV外顯子4區(qū)域的主要立即早期抗原HCMVUL123，檢測CMV DAN；β-globin 作為內(nèi)參。應(yīng)用QIAamp DNA blood mini kit在200μL全血中提取CMV DNA。5μL DNA樣本和20 μL反應(yīng)混合物加入微板孔中，以無菌水作為陰性對(duì)照。PCR條件為：預(yù)變性95°C 10 min；變性95°C 15s，退火60°C 1 min，45個(gè)循環(huán)。應(yīng)用CFX96實(shí)時(shí)定量系統(tǒng)，檢測閾值為最低65 拷貝/mL，試驗(yàn)中檢測CMV DNA的線性范圍從790到5×106拷貝/mL。

1.4 CMV感染和CMV疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn) CMV疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)為，具有臨床癥狀：不明原因的發(fā)熱，白細(xì)胞<4×109/L，血小板<150×109/L

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用MedCalC和SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果

2.1 CMV DNA PCR法與CMV抗原檢測定性結(jié)果的比較 479個(gè)樣本取自79例患者，其中29例患者檢測一次，50例患者反復(fù)進(jìn)行檢測。檢測樣本結(jié)果如下表1。

2.2 CMV DNA PCR法與CMV抗原檢測定量結(jié)果的比較 應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析，分析顯示兩種方法間存在中等的相關(guān)性（r=0.5504，P<0.0001）圖1。

圖1 實(shí)時(shí)定量PCR法與抗原檢測法的相關(guān)性分析。

Pearson相關(guān)性分析顯示，兩種方法間存在中等的相關(guān)性（r=0.5504，P<0.0001）

2.3 CMV DNA PCR法與CMV抗原檢測法對(duì)臨床治療的評(píng)估 13例CMV患者應(yīng)用更昔洛韋進(jìn)行抗病毒治療，進(jìn)行反復(fù)的病毒檢測。首次檢出CMV陽性的時(shí)間（中位時(shí)間），CMV DNA PCR法為15.5d（0～56d）；CMV 抗原檢測法23.5d（8～252d）。治療前，檢測患者病毒中位載量為2716拷貝/mL（<65～93918拷貝/mL）；CMV 抗原檢測法，中位陽性細(xì)胞為3/200000 白細(xì)胞（0～351/200000白細(xì)胞）。治療后，臨床檢測CMV轉(zhuǎn)陰中位天數(shù)為：CMV DNA PCR法36.0d（11～57d）；CMV 抗原檢測法25.5d（3～53d）。

3討論

CMV抗原檢測和CMV DNA PCR廣泛被應(yīng)用于CMV的首次感染、再燃和早期CMV治療[3]。然而，針對(duì)不同患者群體，不同機(jī)構(gòu)對(duì)于臨床診斷CMV感染的閾值均不統(tǒng)一。

我們證實(shí)兩種方法在檢測全血樣本時(shí)一致性高達(dá)86.4%，這與同類研究結(jié)果一致。但兩種檢測方法間仍存在差異，在65例差異樣本中，61例（93.8%）是CMV DNA PCR陽性結(jié)果，而抗原檢測為陰性，而這61例中45例的檢測結(jié)果低于熒光定量的線性區(qū)間（<790 拷貝/mL）。這種現(xiàn)象可以用CMV DNA PCR較高的敏感性來解釋。對(duì)于兩種檢測法的定量研究顯示，PCR法和抗原檢測具有中等的相關(guān)性（r= 0.5504，P<0.0001），這也與之前的研究相一致。因此，采取治療措施需要謹(jǐn)慎，這種標(biāo)準(zhǔn)的確定需要根據(jù)不同試驗(yàn)室的條件，以及采取方法的敏感性，不宜采用刻板的數(shù)字標(biāo)準(zhǔn)。

總之，應(yīng)用Q-CMV實(shí)時(shí)定量試劑盒檢測CMV感染，與抗原檢測法具有良好的相關(guān)性，且更加敏感，可以被應(yīng)用于早期的CMV感染檢測，并應(yīng)用于指導(dǎo)治療。

參考文獻(xiàn)：

[1]Paya CV. Prevention of cytomegalovirus disease in recipients of solid-organ transplants[J].Clin Infect Dis，2001，32：596-603.

[2]Boeckh M and Boivin G. Quantitation of cytomegalovirus： methodologic aspects and clinical applications[J].Clin Microbiol Rev，1998，11：533-554.

[3]Paya CV， Wilson JA， Espy MJ， et al. Preemptive use of oral ganciclovir to prevent cytomegalovirus infection in liver transplant patients： a randomized， placebo-controlled trial[J].J Infect Dis，2002，185：854-860.

編輯/孫杰