摘要：目的 介紹鈣化材料掃描電鏡的制備方法。方法 取小型豬牙齒標(biāo)本，經(jīng)過(guò)固定，清洗，脫水，鍍膜，然后上鏡觀察。結(jié)果 在掃描電鏡下觀察取得了滿意的圖片和能譜信息。結(jié)論 通過(guò)科學(xué)的制備過(guò)程鈣化材料掃描電鏡顯微鏡取得良好的圖像信息。

關(guān)鍵詞：掃描電鏡顯微鏡；能譜儀；牙本質(zhì)

掃描電子顯微鏡由于具有分辨率高，放大倍率寬，三維立體成像好，樣品制備簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，在各個(gè)行業(yè)的得到了廣泛應(yīng)用。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域掃描電子顯微鏡主要用于樣品表面結(jié)構(gòu)的超微觀察以及通過(guò)掃描電子顯微鏡配套的能譜儀（EDS）檢測(cè)樣品出射的特征X射線，提供材料的化學(xué)成分的定性或定量分析結(jié)果。由于醫(yī)學(xué)材料具有質(zhì)地柔軟，容易變形，導(dǎo)電性能差，二次電子發(fā)射率低以及含水量多等特點(diǎn)，所以生物樣品的制備一直是實(shí)驗(yàn)中的重點(diǎn)與難點(diǎn)。醫(yī)學(xué)材料主要分為：組織材料（舌，心，血管），鈣化材料（牙，骨），液體材料（血液，精子，卵子）。其差異性很大所以相對(duì)處理方法也各不相同。以小型豬牙本質(zhì)小管觀察為例，重點(diǎn)說(shuō)一下鈣化材料的制備和觀察方法。

1實(shí)驗(yàn)儀器

本次實(shí)驗(yàn)需要用到萊卡公司的全自動(dòng)臨界點(diǎn)干燥儀 CPD-300，日本電子公司的離子濺射儀JFC-1600，日本日立公司的掃描電子顯微鏡S-4800，日本HORIBA公司的X射線能譜儀 EX-350。

2樣品的預(yù)處理

2.1取樣 實(shí)驗(yàn)采用3個(gè)月小型豬的牙齒。首先對(duì)小型豬麻醉取出牙齒，然后迅速放入液氮中。使其冷凍，變脆，用小錘輕敲，取其牙本質(zhì)斷面較平的直徑不超過(guò)5mm。高度3～5mm之間的樣品塊。

2.2樣品固定與清洗 將樣品顆粒放入濃度為2。5%（pH.7.2）中戊二醛中4°C低溫條件下固定2h。然后用0.1mol/L磷酸緩沖液反復(fù)清洗3次，10min/次。

2.3樣品的干燥 首先將樣品顆粒放入50%酒精中脫水10min，酒精濃度依次增加分別為 70%，80%，90%分別10min，最后使用100%酒精分2次各脫水15min。取出樣品放入CPD-300臨界點(diǎn)干燥儀中，采用預(yù)先設(shè)定好的骨質(zhì)樣品干燥流程90min。

2.4樣品的樣品臺(tái)固定 由于是固體大塊樣品采用銀膠粘合固定導(dǎo)電膠帶搭橋的方法，首先在樣品臺(tái)上涂上銀膠把樣品固定在銀膠上，讓樣品粘牢，冷卻5min使銀膠變?yōu)楣虘B(tài)。取兩條導(dǎo)電膠帶粘在樣品表面，注意不要觸碰需要觀察的部分。這樣固定既可以是樣品牢固的粘在樣品臺(tái)上，而且上下形成了電子通路從而減少得了樣品的放電現(xiàn)象，見圖1。

圖 1 樣品固體示意圖

2.5鍍膜 樣品呈不規(guī)則形大顆粒，需要對(duì)樣品反復(fù)鍍膜從而使金顆粒均勻的灑落在樣品表面，JFC-1600離子濺射儀采用電流為30，正面時(shí)間為40s，周圍四面為20s。這種噴金方法可以有效的抑制樣品的放電現(xiàn)象，金離子均勻的粘貼在樣品表面避免了遮擋要觀察的樣品表面。

2.6樣品觀察 針對(duì)不同材料的樣品以及觀察內(nèi)容的不同，觀察方法也不及相同。本次實(shí)驗(yàn)采用2.0KV的低電壓，以及8.0mm高工作距離觀察。生物樣品觀察大小一般在500nm～1mm。所以工作距離不應(yīng)過(guò)于接近樣品。8.0mm工作距離即可以清楚的觀察到樣品表面又可以增加景深凸顯圖片的三維效果。低電壓有利于減少樣品的放電效果。 能譜觀察需要電鏡的高壓設(shè)為15kv，工作距離設(shè)為15mm。

3結(jié)果

3.1由于采用多種方法對(duì)樣品放電現(xiàn)象進(jìn)行了抑制。圖像沒(méi)有出現(xiàn)放電現(xiàn)象。樣品的牙髓腔，牙髓神經(jīng)以及牙本質(zhì)小管都清晰可見，見圖2，圖3。

圖2 牙本質(zhì)包圍的牙髓腔與牙髓神經(jīng)

圖 3 牙本質(zhì)小管

3.2 對(duì)牙本質(zhì)進(jìn)行了能譜元素分析，從分析結(jié)果來(lái)看牙本質(zhì)主要有元素鈣與磷構(gòu)成。其中鈣元素大概含有65%，磷元素大概含有35%，見圖4，圖5。

圖 4 樣品進(jìn)行檢測(cè)的部位

圖5 樣品檢測(cè)結(jié)果

3.3 對(duì)牙本質(zhì)元素分布進(jìn)行能譜分析，從而發(fā)現(xiàn)在牙本質(zhì)上鈣與磷均勻分布，而在牙髓腔中磷元素的分布大于鈣元素，見圖6。。

圖6 能譜下的鈣元素與磷元素分布

3討論

掃描電子顯微鏡作為觀察樣品超微結(jié)構(gòu)的重要工具其功能變得越來(lái)越強(qiáng)大，相對(duì)應(yīng)的樣品前期制備過(guò)程也在不斷的改進(jìn)。其中制樣過(guò)程中固定、清洗、脫水，噴金這幾步是獲得清晰圖像的前提。隨著人們的不斷試驗(yàn)和總結(jié)已經(jīng)形成了相對(duì)完善的試驗(yàn)步驟。但還存在很多不足。比如：內(nèi)臟樣品制備，單個(gè)血小板的制備，小鼠耳蝸的觀察等等。都還需要人們不斷的摸索和總結(jié)。

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編輯/孫杰