摘要：目的 研究如何提高細(xì)菌性突發(fā)事件的病因診斷實(shí)效性。方法 采集某次食物中毒事件中重點(diǎn)樣品，使用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）雙色熒光檢測試劑對(duì)樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果 本次細(xì)菌性應(yīng)急檢驗(yàn)中16h出病因初步診斷結(jié)果，40h出階段檢驗(yàn)結(jié)果，48h出最終診斷結(jié)果。結(jié)論 細(xì)菌性突發(fā)事件應(yīng)急檢驗(yàn)中，采用PCR方法可在較短的時(shí)間內(nèi)診斷出結(jié)果，能夠有效提高細(xì)菌性病因應(yīng)急檢驗(yàn)的實(shí)效性。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌性應(yīng)急檢驗(yàn)；實(shí)效性；聚合酶鏈反應(yīng)

Abstract：Objective To study how to improve the effectiveness of the etiological diagnosis of bacterial emergencies.Methods The samples were collected on a food poisoning incident，the use of the polymerase chain reaction（PCR）detection of dual color fluorescence detection reagent for sample.Results The bacterial emergency inspection 16 hours out of the initial diagnosis of etiology，40 hour stage test results，48 hours out of the final diagnosis results.Conclusion The bacterial emergency inspection，using the method of PCR can be obtained in a short period of time to diagnosis，can effectively improve the effectiveness of bacterial etiology of emergency test.

Key words：Bacterial emergency inspection；Effectiveness；Polymerase chain reaction

面對(duì)水質(zhì)污染、食物中毒、傳染病等細(xì)菌性污染事件，需要及時(shí)診斷并提高檢驗(yàn)的實(shí)效性。在細(xì)菌性污染事件中，快速而準(zhǔn)確地鑒定細(xì)菌種類是提高細(xì)菌性污染事件處理效率的關(guān)鍵[1]，但傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定方法所需時(shí)間較長，不符合政府要求的快而準(zhǔn)的時(shí)效性。本研究以某次食物中毒事件為例，探討提高細(xì)菌性應(yīng)急檢驗(yàn)實(shí)效性的方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 采集某次食物中毒事件中的重點(diǎn)樣品，包括32份食物中毒患者肛拭子，9份飲用水水樣，10份食物，11份廚工肛拭子，2份冰箱拭子。

1.2方法

1.2.1試劑與儀器 使用儀器包括熒光定量PCR儀、半自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定儀、電熱恒溫培養(yǎng)箱、生物顯微鏡及微生物過濾系統(tǒng)；試劑：PCR雙色熒光檢測試劑（由深圳生科院技術(shù)有限公司生產(chǎn)），各種增菌液、生化反應(yīng)管和選擇性培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限公司生產(chǎn)）。

1.2.2檢測方法 根據(jù)檢驗(yàn)需求，接到標(biāo)本后，采用一種或多種PCR試劑盒對(duì)標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)處理，肛拭子直接劃線接種各種選擇性分離平板，置入肉湯中，進(jìn)行37℃增菌培養(yǎng)，對(duì)飲用水樣品通過微生物過濾系統(tǒng)進(jìn)行抽濾、食物樣品均質(zhì)處理，然后再行增菌培養(yǎng)。6h后取出增菌液100μl，離心5min，棄上清液，加入100μl生理鹽水，離心2min，棄上清液，加20μl裂解緩沖液，并置100℃金屬浴，10min后再次離心2min，保留上清液備用；食物樣品加入少量生理鹽水中，混合均勻后，離心10min，取上清液高速離心5min，加20μl裂解緩沖液，后續(xù)處理同增菌液。按照試劑盒要求，將反應(yīng)液分組混合均勻，按照22μl進(jìn)行分裝，取經(jīng)處理后的各類標(biāo)本上清液3μl加入反應(yīng)液，并取參比品3μl加入相應(yīng)的反應(yīng)液中，同時(shí)上機(jī)行PCR擴(kuò)增循環(huán)，收集熒光信號(hào)，判斷結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1提前純培養(yǎng)并鑒定 有9份樣品在直接劃平板培養(yǎng)9h后，長出疑似沙門菌的菌群。將這些可以菌群提前進(jìn)行半固體瓊脂斜面、三糖鐵瓊脂斜面、蛋白胨水、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、尿素瓊脂、蛋白胨水的接種，并置于37℃進(jìn)行純培養(yǎng)。挑選出提示為半固體瓊脂斜面培養(yǎng)6h后的純培養(yǎng)物，行API生化鑒定及血清凝集試驗(yàn)。接到樣品后16h，根據(jù)血清試驗(yàn)和PCR檢測的結(jié)果，初步判斷食物中毒的致病因子為沙門氏菌。

2.2生化鑒定結(jié)果 分離平板20h之后，培養(yǎng)出典型沙門氏菌群。接到樣品后40h，結(jié)合血清學(xué)試驗(yàn)、鏡檢菌體形態(tài)、和生化反應(yīng)的結(jié)果，并經(jīng)API生化鑒定試劑盒鑒定，確定結(jié)果為腸炎沙門氏菌。

2.3最終結(jié)果 根據(jù)對(duì)不同批次的培養(yǎng)物穿插培養(yǎng)和鑒定試驗(yàn)的結(jié)果，接到樣本后48h內(nèi)，陸續(xù)檢出腸炎沙門氏菌的樣品患者肛拭子23份、廚工肛拭子7份、冰箱拭子l份。結(jié)合流行病學(xué)的調(diào)查，最終確定為腸炎沙門氏菌感染。

3 討論

近年來，我國發(fā)生的微生物細(xì)菌中毒事件逐漸上升，細(xì)菌性食物中毒是較為常見的微生物食物中毒[2]。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定方法主要是通過樣品分布增菌，增加病原的可檢出率。以檢測有害微生物而言，測定菌群總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法是在無菌情況下，將待測樣品稀釋，取2～3種適宜的稀釋度，將1ml的每種稀釋度大測樣品放入15ml培養(yǎng)基的滅菌平皿中在（36±1）°溫箱中培養(yǎng)（48±2）h，取出計(jì)算平皿中菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即得每克或每毫升樣品中所含的菌落總數(shù)。實(shí)驗(yàn)的過程中，還需要做出平行樣品并作空白對(duì)照。這種方法培養(yǎng)的時(shí)間較長，且對(duì)檢測人員的工作經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)水平以及檢測條件要求比較嚴(yán)格[3]。

目前，許多新的快速檢測正在迅速發(fā)展，如比色DNA雜交檢測法、基因探針法聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR）等分子生物學(xué)方法；此外還有抗阻法等生物化學(xué)法，其中PCR是上世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的的一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有快速便捷、特異度及敏感度高、易自動(dòng)化等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)檢驗(yàn)兩種細(xì)菌，節(jié)省時(shí)間，大大提高了檢測的效率[4-5]。此次病因診斷，16h出初步診斷結(jié)果，報(bào)告階段檢驗(yàn)結(jié)果的時(shí)間為接樣后40h，在接樣后48h出最后診斷結(jié)果。根據(jù)這個(gè)診斷結(jié)果，表明在細(xì)菌性病因應(yīng)急檢驗(yàn)中應(yīng)用PCR方法可有效提高縮短細(xì)菌鑒定時(shí)間，提高檢驗(yàn)的實(shí)效性。檢測過程中，應(yīng)嚴(yán)格做好PCR檢測儀的質(zhì)量控制，分清楚出現(xiàn)的假陽性和假陰性，將它的檢驗(yàn)結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果結(jié)合判斷，并作為結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。

綜上，對(duì)于細(xì)菌性突發(fā)事件，檢驗(yàn)人員應(yīng)充分認(rèn)識(shí)到應(yīng)急檢驗(yàn)實(shí)效性的重要作用，以最快的速度和準(zhǔn)確的結(jié)果報(bào)告初步結(jié)果，分階段報(bào)告檢驗(yàn)結(jié)果和最終結(jié)果。充分利用流行病學(xué)的調(diào)查，不拘泥于傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法，利用快速檢驗(yàn)設(shè)備及試劑作出快速檢驗(yàn)。對(duì)重點(diǎn)樣品進(jìn)行可疑菌種的重點(diǎn)監(jiān)測，提高診斷的效率。

參考文獻(xiàn)：

[1]高安平.細(xì)菌性食物中毒回顧性檢測分析[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2013，8（29）：30-31.

[2]金晶，殷愛芹，徐子茗，等.細(xì)菌性食物中毒檢測臨床意義[J].中外健康文摘，2010，7（8）：108-108.

[3]宋寧生.細(xì)菌性食物中毒檢驗(yàn)技術(shù)探討[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（B12）：51-53.

[4]王寒冰.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食源性細(xì)菌檢測中的應(yīng)用效果評(píng)價(jià)[J].武警后勤學(xué)院學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，19（2）：96-98.

[5]黃薇，趙翔，唐曉旻，等.核酸檢測技術(shù)在細(xì)菌性食源疾病檢測中的應(yīng)用探討[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，38（2）：344-347.

編輯/哈濤