摘要：為評(píng)估幾種方法在家畜布魯氏菌鑒定中的作用，也為了解新疆部分地區(qū)家畜布魯氏菌不同菌種在牛、羊間的感染率及在不同家畜間的轉(zhuǎn)移情況，在南北疆3個(gè)采樣點(diǎn)，共收集病原學(xué)組織（牛、羊流產(chǎn)胎兒）病料263份。經(jīng)細(xì)菌分離加凝集試驗(yàn)得到20株可疑布魯氏菌，對(duì)上述可疑菌株經(jīng)VirB8-PCR和AMOS-PCR方法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定、確定了16個(gè)布魯氏菌株，其中9株為羊種布魯氏菌，另7株為牛種菌。試驗(yàn)結(jié)果顯示，采樣點(diǎn)家畜中，羊種布魯氏菌感染率為3.4 %，而牛種布魯氏菌感染率為2.6%。而沒(méi)發(fā)現(xiàn)不同家畜間菌種轉(zhuǎn)移。上述方法中，AMOS-PCR方法有特異性高、便利、快速等特點(diǎn)，在布魯氏病病原學(xué)鑒定中推廣和應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：布魯氏菌病；細(xì)菌學(xué)分離；VirB8- PCR；AMOS-PCR

Comparison of Different Methods to Identify the Domestic Animal Brucellosis Strains in Parts of Xinjiang

DUOLIKUN·Nuershafa，MIJITI·Muhetaerhan，AMANGULI·Mamuti

（Xinjiang Uyghur Autonomous Region Animal Health Epidemic Prevention and Monitoring Station，Urumqi 830011，Xinjiang，China）

Abstract：To evaluate the different methods for domesticanimal brucellosis identification， also to understand the domestic animal brucellosis different strains infection rates among the cattle and sheep and the occurrence of strains transfer in between different animals in some areas of Xinjiang.263 of pathogenic tissues （cattle， sheep aborted fetuses） samples were collected from northern and southern 3 parts of the Xinjiang.After bacteria separation and agglutination test， the 20 strains of suspicious brucellosis were isolated， among them 16 suspicious strains were further identified by using of Virb8-PCR and AMOS-PCR methods， among them 9for Br.meltitensis and7 for Br.abortus .The results showed that the infection rate of Br.meltitensis and Br.abortus was 3.4% and 2.6%respectively， in the domestic animal samples collecting area， and no evidence were founded of strain transfer between different animals. Among these different methods， the AMOS-PCR methods had high specificity， convenient， fast etc； the method has certain popularization and application value in the identification ofpathogen of brucellosis.

Key words：Brucellosis；bacterial isolation；VirB8- PCR；AMOS-PCR

布魯氏菌病是世界范圍內(nèi)廣泛流行，尤其是對(duì)以畜牧業(yè)為主的發(fā)展中國(guó)家造成較大危害的重要人畜共患病[1]。傳統(tǒng)病原學(xué)方法在布魯氏菌病的診斷確診中是金標(biāo)準(zhǔn)、該方法以較高的特異性能夠鑒別不同種型的同時(shí)，還能確定疫區(qū)和傳染源，但與PCR方法比較，前者在耗時(shí)、操作安全性、敏感性等方面有明顯差異。PCR方法在布病病原學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域中的成功利用，在一定程度上克服傳統(tǒng)方法的上述缺點(diǎn)的同時(shí)提高了布魯氏菌株種、屬性鑒定水平，而PCR方法有抗原不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。為此我們?cè)O(shè)計(jì)運(yùn)用細(xì)菌分離加分子生物學(xué)的病原學(xué)檢測(cè)方案，對(duì)我區(qū)部分地區(qū)的牛、羊布魯氏菌菌種進(jìn)行鑒定，同時(shí)了解不同菌株在不同動(dòng)物間是否存在菌種轉(zhuǎn)移情況，達(dá)到通過(guò)特異、敏感、安全、快速的檢測(cè)方法，確診菌株，實(shí)施科學(xué)預(yù)防措施為目標(biāo)，開(kāi)展了此次檢測(cè)鑒定工作，具體檢測(cè)鑒定結(jié)果回報(bào)如下。

1資料與方法

1.1檢測(cè)病料及有關(guān)數(shù)據(jù) 在新疆南北疆設(shè)3個(gè)未布病疫苗免疫采樣點(diǎn)共收集病原學(xué)組織（牛、羊流產(chǎn)胎兒）病料263份，其中羊流產(chǎn)胎兒223份、牛流產(chǎn)胎兒40份。流產(chǎn)胎兒所屬畜主、飼養(yǎng)家畜、孕畜、流產(chǎn)、布病免疫情況及家人身體狀況等數(shù)據(jù)信息以填表的方式記錄保存。

1.2試驗(yàn)材料

1.2.1主要試劑 瓊脂粉；胰蛋白示（TRYPTOSE）；布魯氏菌試管凝集試驗(yàn)陽(yáng)性、陰性血清由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司購(gòu)置；VirB8- PCR試劑及AMOS-PCR試劑由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供。

1.2.2儀器耗材 生物培養(yǎng)箱；玻璃干燥缸；PCR儀；電泳儀；圖像分析儀；一次性培養(yǎng)皿；蠟燭；移液槍頭；微量加樣器等。

1.3方法

1.3.1布魯氏菌的分離培養(yǎng) 無(wú)菌取牛、羊流產(chǎn)胎兒，肝、脾、胃液等組織及胃內(nèi)容，其中每份牛犢組織病料同時(shí)開(kāi)展需氧和厭氧培養(yǎng)，而羔羊組織病料只進(jìn)行需氧培養(yǎng)[2]，37℃培養(yǎng)7d，觀察菌落生長(zhǎng)情況。挑取可疑菌落、用布魯氏菌陽(yáng)性、陰性血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，對(duì)在陽(yáng)性血清中凝集的可疑菌株，進(jìn)行進(jìn)一步純化培養(yǎng)，對(duì)純化可疑菌株、采用分子生物學(xué)PCR方法進(jìn)行分析鑒定。本試驗(yàn)是用PCR鑒定試驗(yàn)代替?zhèn)鹘y(tǒng)布魯氏菌病細(xì)菌學(xué)分離鑒定方法中的生化鑒定試驗(yàn)，即不開(kāi)展硫化氫產(chǎn)生、染料抑菌、單項(xiàng)特異血清A、M及粗糙R血清凝集、噬菌體裂解試驗(yàn)等生化試驗(yàn)。

1.3.2 PCR方法 取上述細(xì)菌學(xué)方法分離的可疑菌株，用布魯氏菌VirB8-PCR和AMOS-PCR兩種方法不同的試劑按說(shuō)明進(jìn)行試驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1布魯氏菌可疑菌株的分離 細(xì)菌學(xué)分離方法共分離20株可疑菌株，其中從羊流產(chǎn)胎兒中分離到11個(gè)株菌，牛流產(chǎn)胎兒中檢出9個(gè)株菌。

2.2 VirB8- PCR和AMOS-PCR試驗(yàn)結(jié)果 從上述20株可疑菌中，VirB8-PCR方法檢出了19株布魯氏菌（見(jiàn)圖1部分菌），但是該試劑不能鑒別該菌的種屬，AMOS-PCR方法檢出16株布魯氏菌（見(jiàn)圖2部分菌），同時(shí)該試劑能鑒別牛種和羊種布魯氏菌，其中9株羊流產(chǎn)胎兒分離菌株均為羊種布魯氏菌，7株牛分離菌株均為牛種布魯氏菌，羊種布魯氏菌感染率為3.4%、牛種布魯氏菌感染率為2.6%。檢測(cè)結(jié)果顯示不同畜間未發(fā)現(xiàn)布魯氏菌菌種轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。細(xì)菌學(xué)方法及兩種PCR方法鑒別結(jié)果的對(duì)比，見(jiàn)表1和圖3。VirB8- PCR布魯氏菌均出現(xiàn)的擴(kuò)增帶為716 bp，AMOS-PCR牛種、羊種布魯氏菌均出現(xiàn)的擴(kuò)增帶分別為498 bp和731 bp。

圖1 VirB8- PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示 圖2 AMOS-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示

注：圖1：VirB8- PCR擴(kuò)增結(jié)果，M：Marker.1：羊流產(chǎn)胎兒中分離可疑菌株：1#、2#、4#、5#。牛流產(chǎn)胎兒中分離可疑菌株：3#、6#。圖2：AMOS- PCR擴(kuò)增結(jié)果，M：Marker.1：羊流產(chǎn)胎兒中分離可疑菌株：1#、2#、3#、4#、5#、6#、8#，牛流產(chǎn)胎兒中分離可疑菌株7#、9#。

圖3 細(xì)菌學(xué)方法及兩種PCR方法鑒別結(jié)果的對(duì)比圖

3討論分析

3.1布魯氏菌病的病原學(xué)檢測(cè)在布病疫情判斷，成功實(shí)施有效防制措施等方面最可靠和重要方法之一。布魯氏菌病細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法雖然能從被檢病料中直接檢出致病菌，還能進(jìn)行菌性鑒定和鑒別種、屬，但所需時(shí)間較長(zhǎng)、比較繁瑣，條件苛刻，檢出陽(yáng)性率較低[3]，生物安全性差，實(shí)驗(yàn)人員需進(jìn)行嚴(yán)格培訓(xùn)才能操作，因此上述該方法在逐步退出檢測(cè)方法行列之中[4]。綜合上述因素，本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)菌學(xué)方法進(jìn)行簡(jiǎn)化，用特異、敏感、相對(duì)安全、快速的[5]PCR方法代替細(xì)菌學(xué)生化鑒定。兩種PCR方法中VirB8- PCR方法較敏感，檢出率高，但只能鑒別布魯氏菌、不能種屬區(qū)分，而AMOS-PCR方法檢出率低，顯示特異性高，且能鑒別種屬，所以AMOS-PCR方法推廣運(yùn)用的價(jià)值較高。

3.2試驗(yàn)鑒定確診此次引起該流產(chǎn)的病因是牛感染牛種和羊感染羊種布魯氏菌。三種試驗(yàn)的出菌率方面；細(xì)菌學(xué)方法疑似布魯氏菌出菌率為7.6%，VirB8- PCR為7.2%，AMOS-PCR為6.08%。AMOS-PCR方法，在出菌率方面比細(xì)菌學(xué)方法底1.52%，比VirB8- PCR底0.4%。細(xì)菌學(xué)方法與VirB8- PCR及AMOS-PCR方法的符合率，分別為95%和80%。VirB8-PCR及AMOS-PCR的特異性、比細(xì)菌分離方法分別高5%和20%，相對(duì)而言、特異性最高的是AMOS-PCR其次是VirB8- PCR和分離方法、敏感性相反。對(duì)于AMOS-PCR方法未能檢出的4株菌歸屬問(wèn)題，在以后的工作繼續(xù)細(xì)菌學(xué)生化鑒定，并且與其它方法對(duì)比試驗(yàn)后、給予評(píng)價(jià)。AMOS-PCR方法雖然在特異、便利、安全及快速等方面高于其它兩種方法，但是敏感性需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)。布魯氏菌患病畜群及時(shí)進(jìn)行全檢、檢出陽(yáng)性畜按有關(guān)規(guī)定處理后，未感染家畜進(jìn)行疫苗接種，是保護(hù)人類(lèi)健康、減少經(jīng)濟(jì)損失、在畜間最終根除該病的最有效的方法和必要措施之一[6]。

3.3為了更好地了解我區(qū)家畜布病發(fā)病情況和制定有效預(yù)防措施，今后的檢測(cè)工作中，需進(jìn)一步加大病原學(xué)檢測(cè)工作。開(kāi)展有針對(duì)性的防疫工作的工作中，利用分子生物學(xué)方法對(duì)分離菌株的基因序列進(jìn)行分析，準(zhǔn)確掌握菌種特征，為各類(lèi)預(yù)防措施的及時(shí)順利開(kāi)展，提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/張燕