摘要：目的 了解EB病毒在正常人淋巴細胞、體外培養(yǎng)的EBV轉(zhuǎn)化的淋巴母細胞及誘發(fā)的淋巴瘤細胞三種細胞中LMP的表達情況及表達差異。方法 采用實時定量PCR方法檢測LMP基因在三種細胞中的表達改變。采用Western bolt檢測LMP-1蛋白表達。結(jié)果 實時定量PCR檢測LMP基因在三種細胞中均有表達。同正常細胞相比，LMP-1、LMP-2A、LMP-2B在轉(zhuǎn)化細胞中表達上調(diào)，在誘發(fā)瘤細胞中表達也上調(diào)，且這三個基因在轉(zhuǎn)化母細胞中表達的上調(diào)幅度均大于其在誘發(fā)瘤中的表達。結(jié)論 EB病毒在體內(nèi)和體外可能通過不同的方式誘導細胞突變，促進腫瘤的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：EB病毒；轉(zhuǎn)化淋巴母細胞；病毒基因；LMP-1；LMP-2A；LMP-2B

中圖分類號：R36，R733 文獻標識碼：A

目前已知的EB病毒基表達產(chǎn)物潛伏膜蛋白（latent membrane protein LMP）包括LMP-1、LMP-2A和LMP-2B。LMP-1通常被認為是病毒致癌基因，在腫瘤的形成過程中起著積極作用[1]。在EBV相關(guān)惡性腫瘤中能持續(xù)檢測到LMP-2A轉(zhuǎn)錄物，提示LMP-2A對體內(nèi)病毒持續(xù)感染可能有重要作用。在EBV轉(zhuǎn)化淋巴母細胞中及誘發(fā)瘤細胞中，LMP基因表達情況目前尚未見報道，因此本實驗通過對EB病毒轉(zhuǎn)化淋巴母細胞和誘發(fā)淋巴瘤中LMP-1、LMP-2A、LMP-2B的表達進行檢測，分析在EBV轉(zhuǎn)化淋巴細胞及誘發(fā)淋巴瘤過程中LMP可能起重要作用。

1資料與方法

1.1一般資料 B95-8細胞由中南大學湘雅醫(yī)學院腫瘤研究所饋贈。嚴重聯(lián)合免疫缺陷動物SCID-Beige小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promage公司；SYBR○RPremix Ex TaqTM試劑盒購自Takara公司。

1.2方法

1.2.1 EB病毒轉(zhuǎn)化淋巴母細胞的培養(yǎng) 培養(yǎng)B-958細胞提取EB病毒。分別從7名健康獻血員取外周靜脈血3 ml，分離血液中的正常人淋巴細胞。18 d左右即可建立穩(wěn)定生長的淋巴母細胞系。

1.2.2復制SCID小鼠體內(nèi)誘發(fā)淋巴瘤的動物模型 構(gòu)建PBL/SCID嵌合體小鼠模型[2]，獲得誘發(fā)淋巴瘤后病理學檢查免疫組織化學法檢測確診腫瘤，并確認誘發(fā)瘤的類型

1.2.3實時定量PCR及實時定量PCR結(jié)果計算并western blot 檢測LMP的表達 分別提取正常人人淋巴細胞，對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)化淋巴母細胞，誘發(fā)瘤細胞的總RNA并純化，合成cDNA按試劑盒說明書步奏做實時定量PCR并計算其結(jié)果

1.3統(tǒng)計學處理 實驗所得所有數(shù)據(jù)采用（x±s）表示，轉(zhuǎn)化淋巴細胞、誘發(fā)瘤細胞間比較采用t檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1體外EB病毒轉(zhuǎn)化的永生化淋巴細胞 倒置顯微鏡下，轉(zhuǎn)化淋巴細胞呈圓形，部分細胞呈橢圓型，轉(zhuǎn)化淋巴細胞體積比正常淋巴細胞體積增大，成團、懸浮生長，見圖1。

（A）×200 （B）×400

Fig.1 transformed lymphocytes under the inverted microscope

2.2 SCID小鼠體內(nèi)EB病毒誘發(fā)瘤的獲得和鑒定 SCID小鼠在其胸腔、腹腔內(nèi)形成腫瘤。免疫組織化學檢測結(jié)果顯示：白細胞共同抗原（LCA）陽性，B細胞標記（CD20，CD79a）陽性，T細胞標記（CD3，CD45RO）陰性，病理學診斷為彌漫大B細胞性淋巴瘤。

2.3熒光定量RT-PCR結(jié)果 LMP-1基因在轉(zhuǎn)化細胞中的表達比在誘發(fā)瘤細胞的表達上調(diào)3.37倍（P<0.01），LMP-2A基因在轉(zhuǎn)化細胞中的表達比在誘發(fā)瘤細胞的表達上調(diào)46.74倍（P<0.05）。LMP-2B基因在轉(zhuǎn)化細胞中的表達比在誘發(fā)瘤細胞的表達上調(diào)262.05倍（P<0.05）。

2.4 western blot 檢測LMP-1的表達 采用western bolt方法檢測LMP-1在正常細胞、誘發(fā)瘤細胞和轉(zhuǎn)化淋巴細胞中的表達情況，見圖2。

Fig.2 Expression of LMP-1 protein in three cells

3討論

之前研究顯示LMP的三個亞基能通過不同方式促進腫瘤的發(fā)生。如LMP-1能通過上調(diào)致癌潛能轉(zhuǎn)錄因子，干擾細胞信號轉(zhuǎn)導，幫助病毒免疫逃逸等多種方式促進腫瘤的發(fā)生。LMP-2A可通過增強細胞周期誘導和凋亡抑制等相關(guān)基因的表達[3]，通過調(diào)節(jié)LMP-1的表達等方式促進細胞惡性轉(zhuǎn)化。LMP-2A一方面產(chǎn)生B細胞受體替代物幫助EBV存活，同時阻止B細胞的激活維持EBV的持續(xù)潛伏感染。在這個過程中的作用LMP-2B通過調(diào)整LMP-2A的活性，與其共同維持病毒的潛伏感染。

在本試驗的研究發(fā)現(xiàn)LMP-1基因在轉(zhuǎn)化細胞中的表達比在誘發(fā)瘤細胞的表達上調(diào)3.37倍（P<0.01），LMP-2A基因在轉(zhuǎn)化細胞中的表達比在誘發(fā)瘤細胞的表達上調(diào)46.74倍（P<0.05）。LMP-2B基因在轉(zhuǎn)化細胞中的表達比在誘發(fā)瘤細胞的表達上調(diào)262.05倍（P<0.05）。LMP三個亞基在轉(zhuǎn)化母細胞中表達的上調(diào)幅度均大于其在誘發(fā)瘤中的表達。這個結(jié)果提示EB病毒在體內(nèi)和體外可能通過不同的方式誘導細胞突變，促進腫瘤的發(fā)生。在體內(nèi)環(huán)境中可能發(fā)生了某些抑癌基因的激活，或者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)激活抑制了LMP的表達及作用的發(fā)揮使得其在體內(nèi)誘發(fā)瘤中的表達低于體外轉(zhuǎn)化母細胞中的表達。

本試驗的結(jié)果為后續(xù)研究LMP在體內(nèi)體外不同環(huán)境通過何種途徑誘發(fā)腫瘤提供了基礎，隨著對LMP研究的深入，LMP與EB病毒潛伏感染、信號轉(zhuǎn)導以及腫瘤的發(fā)生等相關(guān)性逐漸明確，LMP將有望成為治療EB病毒相關(guān)性腫瘤的一個靶點。

參考文獻：

[1]Tang Y， Luo C， Cheng A. Expression of latent membrane proteins in Epstein？Barr virus-transformed lymphocytes in vitro[J]. Mol Med Rep，2014，10（2）：1117-1121.

[2]GAN R， XIE X， HE J， et al. Gene analysis of Epstein-Barr virus-associated lymphomas in Hu-PBL/SCID chimeras [J]. Tumori， 2010， 96（3）： 465-472.

[3]PANG MF， LIN KW， PEH SC. The signaling pathways of Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein 2A （LMP-2A） in latency and cancer [J]. Cell Mol Biol Lett， 2009， 14（2）：222-247.

編輯/張燕