摘要：目的 觀察非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中腺癌患者EGFR基因突變情況及其與臨床特征的關(guān)系。方法 采用RT-PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序技術(shù)分析肺腺癌EGFR基因第19和2l號(hào)外顯子突變情況，并分析其與臨床因素的相關(guān)性。結(jié)果 152例肺腺癌患者中有98例（64.5%）發(fā)生EGFR基因突變，其中45例（45.9%）為發(fā)生于第19號(hào)外顯子的突變，54例（54.1%）為發(fā)生于第21號(hào)外顯子的突變。入組患者中，女性突變率為58.2%高于男性（48.1%），且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。非吸煙者突變率為41.5%，低于長期吸煙者（57.1%）。肺腺癌EGFR基因突變患者中，Ⅰ期有50例（51.0%），Ⅱ期20例（20.4%），Ⅲ期28例（28.6%）。結(jié)論 在肺腺癌中，EGFR基因突變以Ⅰ期多見，其中以第21號(hào)外顯子的突變較為常見，與年齡、性別及吸煙無明顯相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：非小細(xì)胞肺癌，表皮生長因子受體，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，基因突變

Mutational Analysis of EGFR in Non-small Cell Lung Cancers with Adenocarcinoma

MIAO Feng，SONG Yang，PANG Lie-wen，CHEN Zhi-ming

（Department of Cardiothoracic Surgery，Huashan Hospital Affiliated to Fudan University，Shanghai 200040，China）

Abstract：Objective To investigate gene mutations of the epidermal growth factor receptor（EGFR）in non-small cell lung cancers（NSCLC）with adenocarcinoma and their relationship with clinical factors.Methods Mutations of exons 19 and 21 of the EGFR in 152 NSCLC with adenocarcinomas were detected by Real-time PCR-amplifying and gene sequencing，and the relationship between mutations and clinical characters of NSCLC with adenocarcinomas were analyzed.Results We detected 98 EGFR mutations（64.5%）in 152 cases，the majority of which was in-frame exon 45（45.9%）and 54 cases was in exon 21（54.9%）.Moreover，in NSCLC patients with adenocarcinoma，mutations were significantly more frequently observed in females（58.2%）than in males（48.1%），and significantly lower in non-smokers（41.5%）than in smokers（57.1%）.In adenocarcinoma patients with mutation of EGFR，we detected 50 cases in StageⅠ（51.0%），20 cases in StageⅡ（20.4%），28 cases in StageⅢ（28.6%）.Median survival of EGFR mutations patients is 23.10±1.61 months.Conclusion Our data suggest that mutation frequency of EGFR in lung cancers patients with adenocarcinomas is Stage I，and majority of which were in exon 21.

近年來以手術(shù)治療結(jié)合以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為靶點(diǎn)的分子靶向治療已經(jīng)成為肺腺癌一種新的治療方案，以提高肺腺癌患者的生存質(zhì)量和無瘤生存期。多項(xiàng)臨床研究顯示，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）治療突變型肺癌的有效率可以高達(dá)50%[1-3]。靶向藥物治療肺腺癌的潛在臨床反應(yīng)決定于肺癌患者EGFR突變，EGFR-TKI結(jié)構(gòu)域的前4個(gè)外顯子（外顯子18～21）發(fā)生突變的患者對(duì)靶向藥物的反應(yīng)較好，其中，外顯子19和21是肺癌患者體細(xì)胞的EGFR突變最常見的兩種類型[4]。

我們對(duì)符合入選標(biāo)準(zhǔn)的152例肺腺癌患者體細(xì)胞進(jìn)行了EGFR外顯子19及2l基因測(cè)序，并分析腺癌EGFR突變的異質(zhì)性與其臨床特征間的關(guān)系，從而為肺腺癌的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院152例NSCLCs患者手術(shù)切除腺癌組織標(biāo)本。152例肺腺癌患者均有完整的臨床病理資料，患者術(shù)前均未經(jīng)過放療、化療等治療。其中女77例，男75例，年齡22～78歲。突變肺腺癌臨床病理分期：Ⅰ期74例，Ⅱ期50例，Ⅲ期28例。1.2基因測(cè)序 ①取腫瘤組織30mg，先使用組織DNA抽提試劑盒（天根）對(duì)組織樣本進(jìn)行DNA抽提，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度，然后根據(jù)測(cè)定的濃度將樣本稀釋到工作濃度5～10ng/ul；②引物設(shè)計(jì)與合成：擴(kuò)增EGFR基因外顯子19及21引物設(shè)計(jì)[2]。針對(duì)Del E746-A753和L858R突變?cè)O(shè)計(jì)的特異引物，參照GenBank上的EGFR基因全序列檢索，反向引物同上述聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）常規(guī)引物，向引物針對(duì)突變?cè)O(shè)計(jì)為第19外顯子的上游引物為5'-AGCATGTGGCACCATCTCAC-3'，下游引物為5'- GCAGGGTCTAGAGCA GAGCAG-3'；第20外顯子上游引物為5'- CCCTCCTTCTGGCCACCAT-3'，下游引物為5'-TATCCCCATGGCAAACTCTTG-3'；引物由寶騰生物工程有限公司提供；③PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序：按照反應(yīng)體系配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Sanger測(cè)序法（ABI 3730）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到結(jié)果。按照反應(yīng)體系配制反應(yīng)混合液，Taq-man ARMs探針法（ABI 7500）進(jìn)行檢測(cè)分析，得到結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，應(yīng)用列聯(lián)表，檢驗(yàn)分析EGFR突變與患者性別、組織學(xué)類型和吸煙狀態(tài)及年齡之間的關(guān)系，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性。

2 結(jié)果

2.1腺癌EGFR基因突變與患者臨床特征之間的關(guān)系 152例肺腺癌標(biāo)本，共檢測(cè)到98例EGFR突變（64.5%），腺癌EGFR基因突變?cè)谂曰颊咧兴嫉谋壤?8.2%）顯著高于男性患者（41.8%），且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（χ2=5.177，P<0.05），而與患者年齡無關(guān)，見表1。

2.2腺癌EGFR基因突變的相關(guān)因素 Ⅰ期患者EGFR突變率為67.6%，Ⅱ期突變率為40%，Ⅲ期突變率為100%；EGFR突變率在不同臨床分期之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。82例非吸煙病例34例突變（41.5%），低于有吸煙病史的患者（57.1%）（P>0.05）。見表2。

在所有EGFR突變患者中，外顯子19突變的肺腺癌患者病理類型中：Ⅰ期有23例（51.1%），Ⅱ期12例（26.7%），Ⅲ期10例（22.2%），且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。外顯子21突變率在女性患者（60.4%）較男性患者（39.6%）高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。外顯子21突變的肺腺癌患者病理類型中：Ⅰ期有6例（50.9%），Ⅱ期6例（15.1%），Ⅲ期4例（34.0%），且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表3。

2.3 EGFR基因突變情況 在152例肺腺癌標(biāo)本中，我們共發(fā)現(xiàn)三種框架刪除突變，其中最常見的是2235_2249del GGAATTAAGAGAAGC，它直接導(dǎo)致5個(gè)氨基酸的缺失（E746-A750del）。在外顯子21，所有檢測(cè)到的突變均為2573位核苷酸的點(diǎn)突變（2573T-G），此突變導(dǎo)致精氨酸替代了亮氨酸（I58R）。

3 討論

EGFR-TKI治療NSCLCs已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，其治療肺癌的療效與EGFR基因突變有關(guān)。在EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌患者中超過70%的患者對(duì)EGFR-TKI藥物敏感，相比之下，沒有EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌患者中只有10%的患者對(duì)EGFR-TKI藥物敏感[5]。有研究顯示：女性、腺癌、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、化療和吸煙指數(shù)等因素與NSCLC中EGFR基因突變相關(guān)[6]；在本研究中152例肺腺癌標(biāo)本，共檢測(cè)到98例EGFR突變（64.5%），在所有病例中有57例女性突變（58.2%），明顯高于男性患者的突變率（41.8%），且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（χ2=5.177，P<0.05）。然而，本研究中是否吸煙這一因素?zé)o顯著相關(guān)性，與文獻(xiàn)不符，可能的原因是入組樣本量較小，近幾年女性患者吸煙人數(shù)增加，造成納入實(shí)驗(yàn)組的吸煙人數(shù)比例與對(duì)照組基本近似，造成吸煙這一因素?zé)o顯著性差異[7]。

EGFR突變?cè)诓煌呐R床病理分期之間有顯著差異，以肺腺癌的Ⅰ期多見，說明能夠早期發(fā)現(xiàn)的肺腺癌中，突變比例明顯增高；中晚期的肺腺癌患者，因?yàn)檩^容易轉(zhuǎn)移的特征，發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)沒有手術(shù)指征，所以分期較晚的患者，突變比例低。

EGFR突變主要發(fā)生在外顯子18-21，使用GFR-TKI藥物治療伴有EGFR不同突變類型的患者，其臨床療效也有明顯區(qū)別，其療效與EGFR基因外顯子18、19和21（編碼胞內(nèi)酪氨酸激酶活性區(qū)域）的突變有關(guān)[8-9]。在本研究中，外顯子19突變?yōu)?5例（45.9%），外顯子21突變?yōu)?3例（54.1%）。

綜上所述，本研究顯示，肺腺癌中的EGFR基因突變發(fā)生率占64.5%，其中，外顯子19和21位點(diǎn)突變率分別為45.9%和54.1%。EGFR基因突變以Ⅰ期多見，其中以第21號(hào)外顯子的突變較為常見。

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Key words：Epidermal growth factor receptor；Non-small cell lung cancer；Epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor；Gene mutation