摘要：目的 調(diào)查和分析杭州市蕭山區(qū)浙江蕭山醫(yī)院體檢中心女性中人乳頭瘤病毒（H PV） 感染以及基因亞型分布狀況，為預(yù)防HPV感染和宮頸癌防治提供依據(jù)。方法 利用DNA雜交技術(shù)檢測本院體檢中心女性標(biāo)本，并進(jìn)行基因分型。結(jié)果 在2240例樣本中HPV感染者311例，感染率為13.88%，其中高危亞型檢出232例， 占感染者的74.59%，低危亞型54例，占17.36%；同時(shí)感染高危亞型和低危亞型的25例，占8.04%；單一感染254例，占感染者的81.67%，兩重感染42例，占13.50%，≥三重的多重感染15例，占4.82%。23個(gè)亞型中52型最多，其次為43和16型，各年齡段感染率無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)論 蕭山地區(qū)健康體檢女性HPV總感染率為13.88%， 單一感染為本地區(qū)常見類型，以HPV52、43和16為主要感染亞型。

關(guān)鍵詞：人乳頭瘤病毒；基因分型；DNA雜交

Analysis of Human Papilloma Virus Infection State and Genotypes of 2240 Clients in Centre of Physical Examination

ZHONG Rui， WANG Min

（Zhejiang Xiaoshan Hospital， Hangzhou 311201， Zhejiang，China）

Abstract：Objective To study the infection status and genotypes of 23 genotypes of human papillomavirus （ HPV） in Hangzhou City，Xiaoshan district，and to provide theoretical basis for preventing and treating uterine cervical cancer. Methods 2240 samples were detected for HPV genotypes by using DNA hybridization technique. Results 311 cases were HPV， with the positive rate of 13.88%，232 cases belonged to high-risk type only， with the ratio of 74.59% in HPV positive cases， 54（17.36%） cases for low-risk type， 25（8.04%） cases were mixed with high-risk type and low-risk type. Subtype HPV52 occupied the first of all high-risk types， followed by subtype HPV43 and HPV16. 254 cases were the single HPV genotype， with the ratio of 81.67% in HPV positive cases， 42（13.50%） cases were double HPV genotypes， and 15（4.82%） cases were more than three. By the comparison in accordence with the disparity in age section，masculine gender rate in the groups with various age has no significance difference after the chi-square test. Conclusion Healthy check-up women in Xiaoshan area HPV the total infection rate was13.88%. Single genotype is the most common HPV infection type，and HPV52、HPV43 and HPV16 are the major subtypes.

Key words：Human papillomavirus；Genotype；DNA hybridization

宮頸癌作為一種惡性腫瘤發(fā)病率非常高，僅次于乳腺癌的發(fā)病，在女性癌癥中排列第2位，對女性的身心造成了嚴(yán)重的傷害。Zur Hausen等在20世紀(jì)70年代就從宮頸癌的癌變組織中發(fā)現(xiàn)了人乳頭瘤病毒（HPV），并對其DNA進(jìn)行了研究，得出的結(jié)論是宮頸癌的發(fā)病與感染HPV有密切的關(guān)系，后來的大量的生物學(xué)研究數(shù)據(jù)及流行病學(xué)調(diào)查也證實(shí)了上述結(jié)論。如何更好地預(yù)防HPV感染，成為臨床和科研的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，尤其是HPV疫苗的研制及推廣更受到了專家們的重視。但研究也發(fā)現(xiàn)，感染HPV的幾率和其基因類型受不同地域、不同年齡、不同種族的影響而有所不同，這也成了該領(lǐng)域的難點(diǎn)問題。本文中，筆者以本院體檢中心的2240例體檢女性為研究對象，對其感染HPV的情況及基因分型進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1研究對象和標(biāo)本采集 選擇筆者所在的蕭山醫(yī)院的2240例健康體檢女性為研究對象，該人群包括企事業(yè)單位、政府部門等組織健康體檢人群和個(gè)人自主健康體檢的女性，覆蓋范圍廣，能囊括浙江蕭山區(qū)各個(gè)年齡段的有性生活的女性，被研究女性的年齡范圍在21～85歲，平均年齡（43.5±9.67）歲。健康體檢女性在檢查中用宮頸刷采集女性宮頸口上皮細(xì)胞樣本， 將樣本放入專用細(xì)胞保存液中，4℃保存，2d內(nèi)檢測。

1.1.2儀器 選擇美國ABI公司生產(chǎn)的ABI7500基因擴(kuò)增儀；使用韓國FINEPCR公司提供的Combi-12H分子雜交箱。

1.1.3需要的試劑 ①主要試劑：規(guī)格為20μl/每管的PCR反應(yīng)液，濃度為30%的H2O2，裂解液、礦物油、TMB、膜條、POD；②其他試劑：pH7.0的20倍SSC，pH7.0的10%SDS、pH為5.0的1M檸檬酸鈉，再配制成A、B、C三中液體試劑，其中，A液主要由2倍SSC、0.1%SDS組成，pH值為7.4；B液主要含0.5倍SSC、0.1%SDS，pH值為7.4）；C液主要含0.1moM檸檬酸鈉，pH值為5.4，）。另外需要配置新鮮的顯色液，顯色液中主要含有3%的H2O2 2μl、TMB 1ml及19ml的C液。所需要試劑均來源于深圳亞能生物技術(shù)有限公司，其試劑的配置方法及使用方法可以參照試劑說明書來應(yīng)用。

1.2方法

1.2.1處理樣本 充分洗脫宮頸刷，取1ml含樣本的細(xì)胞保存液置入容量為1.5ml的離心管內(nèi)，對樣本以13000轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速來離心，離心時(shí)間為10min，除去上清液，留取管底沉淀物，在沉淀物中加入100μl的裂解液，在100℃的條件下加熱10min，同樣以13000轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液備檢。

1.2.2 PCR擴(kuò)增處理 1支PCR反應(yīng)管，貼上標(biāo)記，以5000轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速離心2s，在反應(yīng)管內(nèi)加入5μl備檢樣品的DNA，反應(yīng)總體系控制在25μl，在處理試驗(yàn)中要分別設(shè)置陰性及陽性的對照研究。PCR擴(kuò)增試驗(yàn)條件為15min，50℃；10min，95℃；循環(huán)處理35次，反應(yīng)條件分別為：42℃，90s；72℃，30s；94℃，30s）；在72℃的條件下還需要延伸5min。

1.2.3雜交試驗(yàn)及顯色 把固定有23種HPV分型探針的膜條和PCR產(chǎn)物放入A液管中（5ml）， 在沸水中浸泡10min，然后再在雜交箱中雜交1h，雜交箱溫度控制在51℃，在A液管中處理完，將膜條置入51℃的40ml B液管中（可同時(shí)置入4個(gè)膜條），洗滌15min，洗滌時(shí)動(dòng)作要輕柔。棄除洗滌液體，將膜條置入POD溶液內(nèi)，在室溫下輕搖孵育30min，棄除POD溶液，再用A液輕搖2次，5min/次，同樣是在室溫下操作；在室溫條件下，再用C液輕搖1～2min，最后再用新配置的顯色液避光處理膜條，顯色時(shí)間為15min，然后將膜條在清水中浸泡，清洗干凈，取出裝入袋內(nèi)，封好口，在4℃的溫度下保存，還要注意避光。整個(gè)試驗(yàn)可以參照膜條是否出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)或出現(xiàn)的位置來評定是否感染HPV及其基因分型，而在對照膜條上顯示藍(lán)色斑點(diǎn)時(shí)可以證明PCR、雜交、顯色等試驗(yàn)環(huán)節(jié)是正常操作的，此時(shí)得出的數(shù)據(jù)為有效數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將試驗(yàn)中數(shù)據(jù)整理在Excel表中，對數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件來分析處理，其中的計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示對照研究的數(shù)據(jù)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1感染HPV的情況 2240例被檢驗(yàn)的樣本中，311例HPV被檢查出陽性，感染HPV的比例為13.88%，其中232例為高危亞型，在感染者中所占的比例為74.59%，分別為HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68，HPV73及HPV83型；54例為低危亞型，在感染者中所占的比例為17.36%，分別為HPV6、HPV11、HPV42、HPV43及HPV44型；25例同時(shí)感染高危亞型和低危亞型，在感染者中所占比例為8.04%。254例為單純性感染，在感染者中所占比例約為81.67%，42例為雙重感染，在感染者中所占比例為13.50%，15例為三重感染或超過三重感染，其中三重感染者8例，四重感染者6例，五重感染者1例），約占感染者的4.82%。見表1。

2.2 HPV亞型感染情況 在亞型感染中，高危亞型HPV52最多，感染所占比例為3.30%；HPV16的感染率為2.05%，HPV58型感染率為1.52%；MM4型未被查出；低危亞型分布以HPV43型多見，感染所占比例為2.28%，HPV44型未被檢出，HPV亞型感染情況見表2。

2.3感染HPV的年齡分布情況 從年齡分布來看，在2240例被檢女性中，≤25歲者的感染率為28.57%，26～30歲者感染率為11.28%，31～35歲者感染率為12.94%，36～40歲者感染率為18.08%，41～45歲者感染率為14.35%，46～50歲者感染率為13.28%，51～55歲者感染率為11.54%，≥56歲者感染率為12.97%，其中，最高感染率的年齡段為≤25年齡段，經(jīng)卡方檢驗(yàn)（χ2=10.648，P=0.155），與其他年齡段感染率并無顯著性差異（P>0.05）， >25各年齡段之間HPV感染率經(jīng)χ2檢驗(yàn)均無顯著性差異（P>0.05）。HPV感染率存在二個(gè)高峰：①是≤25年齡組，感染率28.57%；②是36～40年齡組感染率18.08%。從感染類型的構(gòu)成比分析，各年齡段單一感染比率均明顯高于復(fù)合感染比率。

3 討論

HPV是DNA雙鏈病毒，形態(tài)較小，在感染皮膚和黏膜鱗狀上皮細(xì)胞方面具有特異性，能導(dǎo)致多種良性病變或惡性病變。目前，HPV病毒已經(jīng)被分離出200多種亞型，其中與女性生殖道疾病有關(guān)的亞型約為40種。依據(jù)HPV的性狀及致病特點(diǎn)的不同，HPV可以劃分為低危和高危兩種類型。低危類型中主要是HPV6，HPV11，HPV42，HPV43及HPV44型等，和皮膚黏膜良性增生性疾病有關(guān)，如低度宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變、尖銳濕疣、尋常疣等，低危HPV感染一般不會(huì)引起惡性病變。高危類型中主要有HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV83和MM4型，高危類型的HPV感染可引起宮頸癌、CINⅡ、CINⅢ等不同部位的惡性癌變。鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生主要與感染HPV16有關(guān)，HPV18則與腺癌的發(fā)生有關(guān)[2]，宮頸癌的發(fā)生約有70%的比例與感染HPV16和HPV18有關(guān)[3]，在過去被研究的宮頸癌患者的病理樣本中大部分都能發(fā)現(xiàn)有HPV高危型感染，因此，得出結(jié)論認(rèn)為感染高危性HPV是引起宮頸癌的確定發(fā)病因子[4]，在臨床上，也把檢查感染HPV基因型作為診斷和治療宮頸癌的非常重要的手段。

在被研究的2240例樣本中，311例感染HPV，感染率為13.88%，單一感染為本地區(qū)常見類型。HPV單一感染中以HPV52最常見，為54例，占單一型感染的21.25%（54/254），其次為HPV43、16和58， 為37例、34例、24例，四者合計(jì)占單一感染者的比例為58.66%。HPV多重感染在臨床上也非常多見，不同研究中所提供的數(shù)據(jù)顯示比例各有差異，筆者研究HPV多重感染者在研究對象中所占的比例為18.32%，與其他研究報(bào)道[5]的8.51%比例相比較偏高，考慮是與不同的檢測方法、不同的人群及區(qū)域差異有關(guān)。在HPV多重感染中，合并HPV52感染最為常見，經(jīng)研究顯示，在多重感染中所占的比例為35.08%，HPV43、HPV16合并的感染在多重感染中所占的比例為24.56%（14/57）、21.05%（12/57）， 可見HPV52、HPV43和HPV16不僅在單純感染中所占比例較高， 同樣在多重感染中也占有較高的比例。所以，對本地區(qū)女性進(jìn)行HPV篩查，應(yīng)重點(diǎn)做好HPV52、HPV43、HPV16和HPV58的檢測?，F(xiàn)在，宮頸癌的發(fā)生和多重感染HPV的相關(guān)性研究結(jié)論不盡相同，有研究認(rèn)為[6]，宮頸癌的發(fā)生與多重感染HPV沒有絕對的正相關(guān)性，其感染級別與感染HPV的類型也沒有什么關(guān)系，而Lee等[7]研究結(jié)果顯示，多重感染相比于單純感染要增加發(fā)生宮頸癌的幾率，約為單純性感染的1.5倍。還有報(bào)道[8]，宮頸癌變程度的升級，感染HPV的檢出率也有所增高；也有專家研究[9]顯示，在宮頸癌患者中，多重感染HPV所占的比例更高，約為37.50%，提示了多重感染HPV與發(fā)生宮頸癌的高度相關(guān)性。筆者所在地區(qū)的具體情況還要進(jìn)一步調(diào)研，才可以得到更準(zhǔn)確的結(jié)論。

HPV基因型分布會(huì)受到不同地區(qū)的差異性的影響，國際癌癥研究協(xié)會(huì)（IARC）最新調(diào)查顯示，宮頸癌患者五種感染率最高的高危亞型為HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV33（中國除外），拍在第6位的是HPV52，第7位是HPV58[10]。各國報(bào)道的HPV高危亞型分布也不相同，Ralston等研究[13]顯示的主要高危亞型是HPV16、HPV53、HPV52、HPV31、HPV66；Patricia等[14]報(bào)道，在巴黎地區(qū)主要高危亞型為HPV16、HPV18、HPV45、HPV33、HPV31、HPV52；在我過的河南西部地區(qū)，感染HPV主要亞型為HPV16、HPV58、HPV31、HPV52、HPV53，此結(jié)論和筆者的研究結(jié)論有所不同。大范圍研究，在亞洲地區(qū)HPV52、58具有較高的感染率，在歐洲國家HPV18、31和45具有較高的感染率，HPV16在各個(gè)地區(qū)均具有較高的感染率。筆者所做的研究中，檢查發(fā)現(xiàn)了21種亞型，MM4和44型未被檢出，HPV52，HPV43，HPV16，HPV58，HPV53，HPV68，HPV18，HPV51，HPV56，HPV59位居前10位，有些數(shù)據(jù)與IARC的研究數(shù)據(jù)不盡相同，但與國內(nèi)蕭山周邊地區(qū)的研究者[11-12]等報(bào)道感染HPV比例最高的五種高危型基本一致。

筆者所在地區(qū)女性在各年齡段之間HPV感染率經(jīng)卡方檢驗(yàn)均無顯著性差異（P>0.05）。HPV感染率存在二個(gè)高峰：①是≤25年齡組，感染率28.57%，這一方面可能因?yàn)楦腥镜母叻迥挲g是20～30歲，另一方面也可能是本研究中≤25年齡組樣本數(shù)n值太小，未能充分代表這一年齡段感染狀況；②是36～40年齡組感染率18.08%，超過35歲的女性HPV感染呈持續(xù)狀態(tài)， 發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)比較高。宮頸癌的發(fā)生有不同微生物的感染，但它是可以早期檢測并能預(yù)防的，且能夠治愈，可見，對于超過35歲的女性一定要做好定期體檢。實(shí)際上，宮頸癌的發(fā)生不是一蹴而就的，從感染HPV到宮頸癌前病變，再發(fā)展到宮頸癌是需要很長的時(shí)間的，這說明了做了HPV基因檢測具有較高的臨床檢查診斷防治價(jià)值。同時(shí)，我們還要了解，感染HPV高危型患者發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)較高，長時(shí)間感染的存在也是發(fā)生宮頸癌的必要因素，所以，要普及宮頸癌相關(guān)的醫(yī)學(xué)知識(shí)，教育女性加強(qiáng)HPV檢查的重要性，讓廣大女性了解HPV感染情況和流行病學(xué)的知識(shí)，盡量做到早檢查、早診斷、早防治，這樣才能降低宮頸癌的發(fā)病率，降低女性宮頸癌的病死率。

參考文獻(xiàn)：

[1]萬磊，萬建平，張燕玲，等.子宮頸癌年輕化趨勢的臨床分析[J].中國腫瘤臨床，2004，31（10）：547-549.

[2]Bulk S， Berkhof J， Bulkmans NW， et al. Preferential risk of HPV16 for squamous cell carcinoma and of HPV18 for adenocaicinoma of the cervix compared to women with normal cytology in the Northernlands [J]. Br J Cancer， 2006， 94（1）：171-175.

[3]Ault KA， Giuliano AR， Edwards RP， et al. A phase I study to evaluate a human papillomavirus（HPV） type 18 L1 VLP vaccine[J]. Vaccine， 2004， 22（23-24）： 3004-3007.

[4]Zur Hausen H. Cervical carcinoma and human papillomavirus： On the road to preventing a major human cancer[J].J Natl Cancer lnst， 2001， 93（4）： 252-253.

[5]吳向暉， 杜趁香， 王焱，等.豫西地區(qū)女性宮頸病變HPV感染分子流行病學(xué)探討[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2010，17（8）：1505-1506.

[6]Munoz N， Bosch FX， de Sanjose S， et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer[J].N Engl J Med， 2003， 348（6）：518-527.

[7]Lee SA， Kang D， Seo SS， et al. Multiple HPV infection in cervical cancer screened by HPV DNAChip[J]. Cancer Letter， 2003， 198： 187-192.

[8]章濤， 婁雪玲， 李彥， 等. 宮頸疾病HPV混合型感染的檢測與分析[J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展， 2009， 18（1）：11-13.

[9]周玉群， 徐虹， 沈默，等. 樂清市育齡婦女宮頸脫落細(xì)胞檢測HPV感染情況及分型[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010， 20（11）：2868-2870.

[10]Munoz N， Bosch FX，Castellsague X， et al. Against which human papillomavirus types shall we vaccinate and screen？ The international perspective[J]. Int J Cancer， 2004， 111（2）： 278-285.

[11]李偉，范超明，陳軍，等. 杭州地區(qū)女性人乳頭狀瘤病毒各亞型感染情況的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2009， 19（12）：2896-2897.

[12]陳占國， 周武， 許張曄， 等. 導(dǎo)流雜交方法檢測人乳頭狀瘤病毒分型的臨床應(yīng)用[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志， 2008， 18 （ 9 ）： 1346 -1347.

[13]Ralston Howe E， Li Z， McGlennen RC， et al. Type-specific prevalence and persistence of human papillomavirus in women in the United States who are referred for typing as a component of cervical cancer screening. [J]. Am J Obsted Gynecol，2009， 200（245）：e1- e7.

[14]Patricia C， Anne R， Alexia S， et al. Different outcome of invasive cervical cancer associated with high-risk versus intermediate-risk HPV genotype[J]. Int J Cancer， 2009， 124：778-782.

[15]郭遠(yuǎn)瑜，汪 敏，趙成國等.杭州市蕭山區(qū)女性HPV感染及分子流行病學(xué)研究 [J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2012， 24 （5）：453-456.編輯/哈濤