張猛 單宏鵬 陳鋒 唐衛(wèi)中

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 廣西南寧 530021）

在正常和癌變的結直腸黏膜上皮組織中ERβ是主要表達的雌激素受體，而ERα則是極少表達或不表達［1、2］。在結直腸組織癌變過程中 ERβ 選擇性表達缺失與結直腸癌分化的惡性程度有相關性，因此ERβ可能在大腸癌變過程中起抑癌的保護性作用［3］。許多共調節(jié)因子蛋白的表達水平或活性的改變會導致ER信號分子的改變［4、5］。特別是共激活因子的過表達和下調共抑制因子可使內分泌治療的抑制作用無效，尤其是在應用選擇性雌激素受體調節(jié)劑（selective estrogen receptor modulators，SERMs）例如他莫昔芬（tamoxifen）［6］。因此進一步開展雌激素受體共調節(jié)因子在結直腸中的作用的研究對CRC的激素替代治療和針對ERβ分子的靶向治療顯得至關重要。本實驗主要研究雌激素受體共激活因子其中之一AIB1在結直腸癌中的表達以及與臨床資料間的關系。

1 材料與方法

1．1 材料 收集廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2014年03月至2014年11月行結直腸癌切除術的結直腸癌及其配對正常組織標本200例，其中男性119例，女性89例，平均年齡55．6歲。納入標準：所有術后病理確診為結直腸癌的病例。排除標準：無足夠的標本量，無詳細臨床資料記錄，患有兩個及其以上的原發(fā)性癌癥、患者術前進行抗癌治療尤其是雌激素替代治療的病例排除。配對正常組織術后病理證實為正常大腸組織。患者臨床資料包括：年齡、性別、民族、腫瘤位置、腫瘤大小、大體病理類型、分化程度、病理分期、有無神經官侵犯、有無血管侵犯、TNM分期。本實驗所用標本采集均經過患者本人知情同意且經過廣西醫(yī)科大學倫理委員會批準。本實驗所有過程依照赫爾辛基宣言（Helsinki Declaration）進行。120例預備進行免疫組織化學檢測的標本按照標準浸泡入10%的福爾馬林溶液中。80例預備進行熒光定量PCR的新鮮組織放入液氮中速凍15 min后小心移入-80°C超低溫冰箱中暫時儲存。

1．2 方法

1．2．1 總RNA的制備和逆轉錄PCR 根據使用說明書從80例新鮮組織中提取總RNA（total RNA）應用總RNA提取試劑盒 （Cat＃12113KD1，AXYGEN，蘇州，中國）。隨即，應用NANODROP2000型核酸檢測儀（Thermo Scientific， CA， USA）通過 A260／A280比值計算total RNA的純度。根據使用說明書應用逆轉錄試劑盒 （Roche Diagnostics，Mannhelm，德國）將total RNA逆轉錄為cDNA（Complementary DNA）。20μL逆轉錄體系在 ABI GeneAmp PCR System 9700 PCR 儀（Applied Biosystems， 新加坡）的反 應 條 件 如 下 ：65°C 10 min、4°C 3 min、25°C 10 min、55°C 30 min、85°C 5 min。 將 cDNA 置于-20°C暫時儲存。

1．2．2 熒光定量PCR（RT-qPCR） 根據使用說明應用 Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）（Roche Diagnostics，Mannhelm，德國）進行熒光定量 PCR（RT-qPCR），在 ABI Step-one PlusTM Realtime PCR System型熒光定量 PCR儀 （Applied Biosystems， 新加坡）的反應條件如下：95°C 10 min、95°C 15s、60°C 1 min 40 個循環(huán)。熒光定量 PCR 的內參為beta-actin以及陰性反應為排除cDNA的PCR反應。靶基因的引物序列為：AIB15’-GGTGCAGCTGAAAGTAAACAGAATG-3’ （forward） 和5’ -TCGTTTATTAACAGTGTGCCTTGGA-3’ （reverse），beta-actin 5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’ （forward） 和 5’ -CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’ （reverse），所有引物均合成于Takara大連公司。應用等比例稀釋法做標準曲線。每一個樣本均重復三次來增加結果的準確性。靶基因的表達量的確定是參照內參表達量應用2-ΔCt公式計算。最后根據ROC曲線的CUTOFF值將靶基因mRNA表達量分為兩組：低表達組，高表達組。

1．2．3 免疫組化（IHC） 將80對應用于免疫組化的癌和正常配對組織從福爾馬林中拿出后進行脫水、石蠟包埋、切片（4微米厚），然后在按比例稀釋的酒精中依次脫蠟，后在檸檬酸修復液（pH=6．0）中高壓修復抗原。然后應用免疫組化三步法試劑盒（ZSGB-bio，北京，中國）進行一下實驗步驟：3%H2O2室溫孵育 10～15 min以消除內源性過氧化物酶活性、1%山羊血清室溫孵育15～20 min封閉抗原、一抗（AIB1抗兔多克隆抗體、1：1600， bs-2919R，Bioss，北京，中國）4°C 孵育過夜、抗鼠 ／兔二抗 37°C 孵育 15～20 min、辣根酶標記鏈霉卵白素37°C孵育15～20 min。隨即進行DAB染色（ZLI-9017，ZSGB-bio，北京，中國），蘇木素復染50s。整個實驗中，人類乳腺癌作為陽性標準。一抗稀釋液代替一抗蛋白孵育作為陰性對照。

1．2．4 免疫組化結果判斷 在單盲情況下每張切片均由兩位病理醫(yī)生獨立判片。細胞質和／或細胞核呈棕黃色顆粒樣物質判讀為陽性表達。著色評分是根據著色深度分為三級：0分無著色、1分為淡黃色或著色模糊、2分為棕黃色、3分為深棕色。在6個不同400倍視野下分別計算總細胞數和陽性細胞數求得陽性率，然后乘以該視野的著色評分，最后求6六個視野平均值為靶蛋白在該切片上的陽性表達 （0～300）以備后續(xù)統(tǒng)計分析。根據陽性表達的ROC曲線的cutoff值來確定陰陽性率，高于cutoff值為陽性，反之為陰性。

1．3 統(tǒng)計學分析 所有的統(tǒng)計學分析均完成于SPSS 16．0 software （SPSS， Chicago， IL， 美國）。癌和配對正常組織組間靶基因／蛋白的差異表達用Student’s t test統(tǒng)計。靶基因的mRNA和蛋白水平表達與病例臨床資料之間關系用卡方檢驗或Fisher確切概率法統(tǒng)計。所有統(tǒng)計P值小于0．05的情況下認為有統(tǒng)計學意義。

表1 AIB1mRNA的表達量與臨床、病例指標之間的關系

表2 AIB1蛋白表達量與臨床、病例指標之間的關系

2結 果

2．1 AIB1 在結直腸癌中的表達 熒光定量PCR確定了AIB1在80例CRC組織和配對正常黏膜上皮組織中的mRNA水平表達。與正常組織相比，AIB1在CRC中表達顯著降低且有統(tǒng)計學意義（P＜0．001）見圖1。根據120對結直腸癌病例的免疫組化

圖1 AIB1在結直腸癌組織和配對正常組織中mRNA的相對表達量，柱狀圖表示的是均數±標準誤，相對表達量的參照標準是 β-ACTIN，Student＇s，檢驗結果是 t=3．938,P ＜0．001

結果最終確定了AIB1的蛋白水平表達。免疫組化結果顯示在癌和正常組織中AIB1在細胞質和細胞核中均有著色且主要著色于細胞質。此外，陽性表達統(tǒng)計結果與RT-qPCR結果一致。AIB1在癌和正常組織中表達差異有統(tǒng)計學意義（χ2=20．741， P ＜0．001），其陽性率分別為29．2% 和58．3%，見圖2。

2．2 AIB1在CRC中的診斷價值 在檢測癌組織中AIB1在mRNA水平和蛋白水平上表達的同時，我們做了ROC曲線判斷AIB1在結直腸癌中的診斷價值。結果我們發(fā)現AIB1在CRC發(fā)生發(fā)展過程中有診 斷預測價 值 ， 其 AUC 值 為 0．709 （CI：0．620～0．798， P ＜0．001），cutoff值為 0．379，見圖 3。

2．3 AIB1與 CRC臨床資料的關系 根據 RT-qPCR的結果，以下結論為AIB1mRNA表達與臨床資料的關系。AIB1的相對表達量僅與腫瘤的大小有關（χ2=5．208， P=0．022），與其他的臨床資料關系均無統(tǒng)計學意義（P ＞0．05）。 同時，根據 Spearman相關分析發(fā)現兩者存在正相關（r=0．255， P=0．022），即

圖 2 A在癌組織中的中AIB1主要著色于癌細胞，炎癥細胞，平滑肌細胞的細胞質（×400）。B在正常組織中AIB1的主要著色于黏膜上皮細胞、腸腺細胞、炎癥細胞、平滑肌細胞（×400）。

圖3 ROC曲線來評價AIB1在結直腸癌中的診斷預測 價 值 ，AIB1 的 AUC 值 是 0．709 （CI：0．620～0．798， P ＜0．001）。

腫瘤越大AIB1的表達量越高見表1。根據免疫組化的結果我們同樣得出蛋白水平的表達量與臨床資料的關系。我們發(fā)現與無脈管侵犯相比，CRC存在脈管侵犯時 AIB1 表達下降（χ2=9．431， P=0，002），且兩者的負相關關系有統(tǒng)計學意義（r=0．223，P=0．015）。同時我們發(fā)現AIB1的表達也與T分期有關（χ2=6．272， P=0．043），但兩者的線性關系無統(tǒng)計學意義 （r=-0．178， P=0．052）。 與之相反的是AIB1與TNM分期存在正相關關系，即癌癥分期越晚 AIB1 表達越高 （χ2=622．95， P ＜0．001， r=0．31，P=0．001），見表 2。

3討 論

共激活因子SRC家族是雌激素受體轉錄共激活因子P160超家族的成員。SRC包括核受體在內的許多轉錄因子。該家族的成員有共同的結構和功能，同時可能在調控ER活性上有重要作用［7］。在ER依賴的基因轉錄中SRC共激活因子在細胞中過表達可增強SERMs興奮活性。當配體高表達時，該家族成員蛋白可明顯增加激素誘導的轉錄且此過程由核受 體 介 導 包 括 ER、PR （progesterone receptor）、TR（thyroid receptor）、GR（glucocorticoid receptor）、RAR（retinoic acid receptor）。

AIB1（amplification in breast cancer1）是 SRC 家族中第三位成員也被稱為 SRC-3、PAC3、ACTR、NCoA3，該因子是在乳腺癌中首先被發(fā)現。AIB1基因位于染色體20q12，AIB1的活性影響增值過程。在乳腺癌腫瘤細胞中AIB1基因大量擴增和高表達。在其他器官惡性腫瘤中比如卵巢、子宮內膜、胃、肝臟和前列腺中也存在AIB1高表達或擴增的現象。

流行病學、病理學、分子生物學均證實雌激素受體（ER）尤其是ERβ在結直腸組織癌變過程中起抑癌的保護性作用［2、3、8］。 經典雌激素受體一配體依賴性信號轉導通路認為，雌激素受體ER和雌激素結合形成激素-受體復合物后隨即發(fā)生構型的改變活化自身形成二聚體并具有轉錄因子的功能，之后募集一些共調節(jié)因子與雌激素受體反應元件ERE結合形成轉錄起始復合物。因此AIB1作為雌激素受體轉錄共激活因子，在結直腸癌中應該具有和ERβ相似的生物學效應，即抑癌的保護性作用。

本實驗結果顯示無論是mRNA水平還是蛋白水平AIB1在結直腸癌中表達降低。因此，AIB1可能參與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中并在其中起抑制作用，然而這一推論卻與先前文獻實驗結果并不一致。用免疫組化檢測110名CRC患者的AIB1的表達發(fā)現與正常黏膜相比，AIB1在癌組織中的表達量顯著升高［9］。同時發(fā)現從正常黏膜組織到腺瘤最后到腺癌這一過程AIB1蛋白表達逐漸升高［10］。從以往的研究可以推測出AIB1在CRC發(fā)展過程中起一個促進因子的作用。然而這些研究僅限于蛋白水平的檢測，本實驗在更多病例數中對同一靶基因同時檢測了mRNA和蛋白水平的表達，且兩者是一致的結果。關于AIB1在結直腸癌進展過程中的具體作用和通路仍需要更多的實驗來證實。

免疫組化中AIB1著色部位的變化反映了特定組織類型對類固醇激素的不同反應。AIB1是核受體的調節(jié)因子主要著色部位為細胞核。在乳腺癌中AIB1陽性反應位于細胞核［11］。然而，在甲狀腺乳頭狀癌組織中，AIB1在細胞質和細胞核均有著色［12］。本實驗中，AIB1在CRC組織中胞質和胞核均有著色，且主要在胞質中。但是AIB1在結直腸癌中的陽性反應部位仍有爭論。Petros D等［9］發(fā)現在結直腸癌組織中的中AIB1主要著色于黏膜上皮細胞，內皮細胞，炎癥細胞，平滑肌細胞的細胞核。Vassiliki Tzelepi等［10］也得出了類似結論。著色部位在某些程度上也同時受到一抗影響，例如，Nicole N Balmer等［13］發(fā)現在免疫組化中用兩種不同克隆體系的AIB1得到不同的AIB1蛋白表達類型，將AIB1（BD）一抗應用于子宮內膜癌得到核表達，AIB1（SC）一抗得到胞質陽性。因此不同克隆體系的一抗可能產生不一致的陽性反應。本實驗發(fā)現的陽性反應主要在胞漿說明與傳統(tǒng)的乳腺癌中參與細胞核受體轉錄調節(jié)不同，AIB1在結直腸癌細胞中可能更多地參與細胞質中的信號傳導。這至少部分證明了AIB1在不同癌癥尤其是乳腺癌和結直腸癌中發(fā)揮不同生物學效應。

從以上AIB1在癌與正常組織中的表達類型可以推測出AIB1在CRC發(fā)生發(fā)展過程中起抑癌作用，分析AIB1與臨床資料之間的關系也部分印證了該假設。結直腸癌出現脈管侵犯時AIB1蛋白表達降低，這說明AIB1表達的減少可能使得癌細胞的侵襲力增大。AIB1與T分期的關系也印證了這一點，雖然AIB1與T分期無直接的負性線性關系，但是從陽性率上依然可以看到T2期AIB1蛋白表達最高（37.3%），T4期AIB1陽性率最低（0%）。 T分期反應的是腫瘤侵襲的范圍和深度，直接影響到治療方式和預后情況，AIB1與T分期的關系這說明AIB1表達量可能影響到腫瘤的進展，并起一定的抑制作用。但是在此過程中出現一些不一致的結論，同樣在蛋白水平AIB1的表達量與TNM分期程正相關，即臨床分期越晚AIB1的表達量越高，這與之前截然相反的結論說明AIB1在結直腸癌中參與的通路非常復雜，而所表現出來的生物學效應也不是簡單的單一模式。AIB1在CRC中可能同時參與促癌和抑癌兩種通路，在不同個體結直腸癌進展過程中由不同因子激活這兩種通路。這一假設也在其他研究中得到佐證。一項對85名結直腸癌患者的研究發(fā)現，較晚的臨床分期更易出現AIB1的過表達，這表明AIB1的過表達可能在CRC發(fā)生發(fā)展過程中有選擇性促進作用［14］。AIB1可抑制CRC細胞系的細胞周期使其處于G1期，從而抑制其增殖［15］。在mRNA水平上我們發(fā)現AIB1僅與腫瘤大小呈正相關，AIB1在mRNA水平和蛋白水平不一致的結果說明AIB1靶基因可能參與在轉錄翻譯過程中尤其是轉錄后調節(jié)通路。但是從總體看mRNA和蛋白表達均在癌中降低，說明轉錄后調節(jié)過程對最終起生物學效應的蛋白質影響不大。

通過本實驗的結果我們認為AIB1可能參與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程，并在這一過程中起一定的抑癌的保護作用，但是這一過程非常復雜。在結直腸癌變過程中，AIB1可能重新參加了新的分子通路，使得其在細胞質中的表達增高，這些分子通路的綜合生物學效應可能促進亦可能抑制癌癥的進展。證明AIB1在CRC中的具體作用機制需要更多更深入的研究。

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