鄒 盈 魏 敏 謝 琪 柳華貴 孟祥河

(1.溫州科技職業(yè)學(xué)院，浙江溫州 325105;2.威海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，山東 威海 264200;3.浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江杭州 310018)

乳酸桿菌是人體中極為重要的益生菌，具有改善胃腸道功能、提高免疫能力、改善機(jī)體營養(yǎng)狀況等良好機(jī)能［1］。但是，由于乳酸桿菌對(duì)外部環(huán)境比較敏感，使含活菌的產(chǎn)品在生產(chǎn)、貯存和運(yùn)輸過程中，活菌量會(huì)迅速減少。此外，當(dāng)乳酸桿菌活菌制劑進(jìn)入動(dòng)物消化道后，因受到膽汁和胃酸等作用，導(dǎo)致到達(dá)腸道的活菌數(shù)量大為下降，限制了乳酸桿菌益生作用的發(fā)揮［2］。因此，利用微膠囊技術(shù)保護(hù)益生菌可使益生菌保持穩(wěn)定的狀態(tài)，使其達(dá)到腸道時(shí)仍保持活性，從而有效發(fā)揮益生功效。

副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)屬于乳桿菌屬中的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)群，是一種新資源食品添加劑，在一定程度上可以起到預(yù)防食物過敏、急性腹瀉和腫瘤發(fā)生等疾病，具有促進(jìn)身體發(fā)育、增強(qiáng)體質(zhì)、延緩衰老和延長壽命的作用，被廣泛應(yīng)用于L-乳酸的生產(chǎn)、乳制品等食品的發(fā)酵、食品的生物保鮮、疫苗的研制、海產(chǎn)品加工廢料的再利用等領(lǐng)域［3］。本研究擬以副干酪乳桿菌為對(duì)象，采用擠壓法比較了不同內(nèi)層壁材、海藻酸鈉和氯化鈣的濃度以及不同保護(hù)劑對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊包埋效果的影響，以期為經(jīng)濟(jì)、高效的副干酪乳桿菌微膠囊工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei):浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;

MRS瓊脂培養(yǎng)基:MRS液體培養(yǎng)基加入1.8% ～2.0%的瓊脂;

增殖培養(yǎng)基:酵母膏 3%、乳糖 2.48%、NH4H2PO40.8%、低聚異麥芽糖 0.5%、馬鈴薯汁 11.97%，Na2CO3調(diào)節(jié)pH 6.2 ～6.6，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱:SPX-150B-Z型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;

超凈工作臺(tái):SW-CJ-1FD型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;

立式壓力蒸汽滅菌器:YXQ-LS-50S11型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;

紫外可見分光光度計(jì):752型，上海光譜儀器有限公司;

數(shù)字酸度計(jì):PHs-3C型，杭州東星儀器設(shè)備廠;

高速冷凍離心機(jī):SCR20BC型，日本日立公司;

冷凍干燥機(jī):ALPHA 2-4 LD plus型，德國Christ公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備 將副干酪乳桿菌以1.5%的接種量接種于MRS增殖培養(yǎng)基中37℃靜置培養(yǎng)21 h，離心去上清液，收集菌泥用無菌生理鹽水洗滌后再次離心，重復(fù)兩次，用適量無菌生理鹽水懸浮菌泥，即為菌懸液。

1.2.2 擠壓法制備副干酪乳桿菌微膠囊 將菌懸液與蛋白質(zhì)壁材、海藻酸鈉按菌膠比為1︰1均勻混合—擠壓滴入氯化鈣溶液—固定30 min—無菌生理鹽水洗滌，過濾—收集囊珠。

通過單因素試驗(yàn)分析蛋白分離物(PI)的種類及不同處理方法(PI與無菌水直接混合2 h;PI與無菌水混合2 h后90℃水浴加熱30 min;PI與蒸餾水混合4 h后于121℃加熱20 min)，內(nèi)層壁材種類(乳清蛋白分離物WPI、大豆蛋白分離物SPI、大米蛋白分離物RPI、明膠、多孔淀粉、糊精)，海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%，2%，3%，4%)、氯化鈣濃度(0.1，0 .2，0.3，0.4 moL/L)，包埋壁材(葡萄糖，乳糖，麥芽糖，蔗糖，大豆低聚糖，低聚異麥芽糖，低聚果糖，海藻糖)，其他類保護(hù)劑(5%甘露醇，5%山梨醇，2%甘氨酸，2%谷氨酸，5%甘油，1%VC，1%VB)對(duì)擠壓法制備的副干酪乳桿菌微膠囊效果的影響。

1.3 分析方法

1.3.1 副干酪乳桿菌活菌數(shù)計(jì)數(shù) 采用菌落總數(shù)平板計(jì)數(shù)法［4］。

1.3.2 副干酪乳桿菌微膠囊的破壁 取適量制備的微膠囊置于0.06 moL/L的檸檬酸鈉解囊液中，37℃、180 r/min振蕩40 min至其完全崩解，以供計(jì)數(shù)。

1.3.3 微膠囊包埋產(chǎn)率與包埋效率的測定 微膠囊包埋產(chǎn)率與包埋效率分別按式(1)和式(2)計(jì)算。

微膠囊中活菌數(shù):取微膠囊0.5 g于50 mL 0.06 moL/L的檸檬酸鈉解囊液中，37℃、180 r/min條件下振蕩40 min至其完全崩解，取1 mL適當(dāng)稀釋后測活菌數(shù)。

微膠囊表面活菌數(shù):取微膠囊0.5 g于50 mL生理鹽水中，37℃、180 r/min條件下振蕩40 min，取1 mL適當(dāng)稀釋后測活菌數(shù)。

1.3.4 副干酪乳桿菌微膠囊在人工胃腸液中的溶出度測定

(1)副干酪乳桿菌微膠囊人工胃腸液耐受性的測定［5］:人工胃液:取稀鹽酸16.4 mL(取鹽酸234 mL，加水稀釋至 1 000 mL)，加蒸餾水約800 mL，再加入胃蛋白酶 10 g，攪拌均勻后定容至1 000 mL，pH 1.35。取制備的副干酪乳桿菌微膠囊樣品0.1 g置于50 mL人工胃液中，37℃、180 r/min條件下分別震蕩處理1，2，3 h后取樣測活菌數(shù)。

(2)人工腸液中耐受性的測定［6］:人工腸液:取KH2PO46.8 g加水500 mL溶解，用0.l moL/L的NaOH溶液調(diào)節(jié) pH至6.8;另取胰蛋白酶10 g加水適量溶解，將兩液混合后，定容至1 000 mL。取制備的副干酪乳桿菌微膠囊樣品0.1 g置于50 mL人工腸液中，37℃、180 r/min條件下分別震蕩處理 15，30，45，60 min 后取樣測活菌數(shù)。

1.3.5 凍干存活率的測定 凍干存活率按式(3)計(jì)算。

干燥后微膠囊的活菌數(shù):取微膠囊0.05 g于50 mL 0.06 moL/L的檸檬酸鈉解囊液中，37℃、180 r/min條件下振蕩30 min使其完全崩解，取1 mL適當(dāng)稀釋后測活菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 副干酪乳桿菌微膠囊內(nèi)層壁材的選擇

2.1.1 分離蛋白壁材及其預(yù)處理方法的選擇 試驗(yàn)分別研究了以WPI、SPI、RPI為壁材對(duì)副干酪乳桿菌包埋效果的影響。熱處理會(huì)誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)展開并影響蛋白聚集程度從而改善其乳化穩(wěn)定性。試驗(yàn)探討了3種預(yù)處理方式:a.采用PI與無菌水直接混合攪拌2 h;b.PI與無菌水混合攪拌2 h后90℃水浴加熱30 min;c.PI與蒸餾水混合攪拌4 h后于121℃加熱20 min。試驗(yàn)中海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，CaCl2濃度溶液濃度為0.1 moL/L。不同PI及處理方式獲得的副干酪乳桿菌微膠囊活菌數(shù)見圖1，包埋產(chǎn)率及包埋效率見表1。由圖1和表1可知，PI種類和PI 3種處理方式對(duì)擠壓法制備副干酪乳桿菌微膠囊的包埋產(chǎn)率及包埋效率影響不大，說明3種分離蛋白與乳酸菌的相容性均較好，而3種處理方式均可實(shí)現(xiàn)分離蛋白充分水合并形成穩(wěn)定的乳化液。對(duì)于SPI，c處理包埋效果略優(yōu)于a、b處理組，說明適當(dāng)?shù)臒崽幚韺?duì)經(jīng)剪切變性的蛋溶膠后期凝膠具有積極意義，此外滅菌處理對(duì)于防止乳酸菌污染也是必要的，因此采用PI與蒸餾水混合4 h后121℃加熱20 min為后續(xù)試驗(yàn)PI的預(yù)處理方式。

圖1 PI處理方式對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊包埋活菌數(shù)的影響Figure 1 Effect of PI processing on viability of microencapsulated Lactobacillus paracasei

表1 PI處理方式對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊包埋產(chǎn)率及包埋效率的影響Table 1 Effect of PI processing on yield and efficiency of microencapsules %

表1 PI處理方式對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊包埋產(chǎn)率及包埋效率的影響Table 1 Effect of PI processing on yield and efficiency of microencapsules %

WPI、SPI、RPI分別為乳清、大豆、大米蛋白分離物。

PI 及處理方式 包埋產(chǎn)率 包埋效率WPI-a 82.14 91.26 WPI-b 78.79 90.32 WPI-c 81.66 90.73 SPI-a 80.52 90.50 SPI-b 79.72 90.67 SPI-c 84.93 91.56 RPI-a 80.21 90.40 RPI-b 78.90 90.79 RPI-c 80.90 90.58

2.1.2 不同內(nèi)層壁材對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊包埋效果的影響 分別以3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的WPI、SPI、RPI、明膠、多孔淀粉、糊精作為內(nèi)層壁材，在外層壁材海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，CaCl2濃度為0.1 moL/L的條件下采用擠壓法制備副干酪乳桿菌微膠囊。由表2可知，明膠的包埋產(chǎn)率最高且明顯優(yōu)于其他壁材，這可能是因?yàn)槊髂z自身的凝膠性可以增強(qiáng)海藻酸鈉與氯化鈣所形成凝膠珠的穩(wěn)定性;分離蛋白的效果優(yōu)于多孔淀粉、糊精以及對(duì)照組，這是因?yàn)闊崽幚磉^的蛋白與氯化鈣交聯(lián)生成的凝膠對(duì)擠壓法制備微膠囊的包埋有一定促進(jìn)作用，但PI壁材種類對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊的包埋產(chǎn)率及包埋效率的影響差別不大。

2.1.3 模擬人工胃腸液環(huán)境下不同內(nèi)層壁材對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊保護(hù)效果的影響 副干酪乳桿菌對(duì)消化系統(tǒng)中低pH的胃酸等耐受性極差，難以有足夠數(shù)量到達(dá)腸道從而發(fā)揮益生作用，而微膠囊的包埋技術(shù)能夠?qū)Ω备衫胰樗峋樌竭_(dá)腸道起一定保護(hù)作用［7］。海藻酸鈣凝膠對(duì)副干酪乳桿菌雖有較好的包埋效果但對(duì)胃酸耐受程度不佳，不能較好地保護(hù)副干酪乳桿菌順利到達(dá)腸道。有一定的耐酸性的WPI等蛋白質(zhì)、多孔淀粉、糊精等物質(zhì)作為內(nèi)層壁材在模擬人工胃液環(huán)境下對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊的保護(hù)效果見表3。由表3可知，副干酪乳桿菌的存活率隨著微膠囊在人工胃液處理時(shí)間的延長而降低，人工胃液對(duì)微膠囊中的副干酪乳桿菌有一定的損害作用;添加內(nèi)層壁材微膠囊中的副干酪乳桿菌存活率比未添加的高，說明內(nèi)層壁材的添加對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊的耐胃酸程度有促進(jìn)作用;6種內(nèi)層壁材中，SPI為內(nèi)層壁材制備的微膠囊在人工胃液環(huán)境中副干酪乳桿菌的存活率最高，WPI和RPI次之，說明分離蛋白對(duì)副干酪乳桿菌耐胃酸保護(hù)性較好;在明膠、多孔淀粉、糊精為內(nèi)層壁材制備的微膠囊中，多孔淀粉為內(nèi)層壁材制備的微膠囊在人工胃液環(huán)境中副干酪乳桿菌的存活率較高，這與多孔淀粉的吸附性能一定程度上保護(hù)副干酪乳桿菌免受胃酸損害有關(guān)。

表2 不同內(nèi)層壁材對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊包埋產(chǎn)率及包埋效率的影響Table 2 Effect of inner wall materials on yield and efficiency of microencapsules %

表2 不同內(nèi)層壁材對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊包埋產(chǎn)率及包埋效率的影響Table 2 Effect of inner wall materials on yield and efficiency of microencapsules %

WPI、SPI、RPI分別為乳清、大豆、大米蛋白分離物。

內(nèi)層壁材 包埋產(chǎn)率 包埋效率WPI 78.67 91.01 SPI 82.14 90.79 RPI 76.71 91.27明膠 98.02 92.56多孔淀粉 74.76 91.28糊精 72.41 90.78空白72.74 90.92

由圖2可知，制備的所有微膠囊在人工腸液處理45 min時(shí)副干酪乳桿菌都能得到基本釋放，釋放的菌數(shù)間沒有顯著區(qū)別(P＞0.05)，說明內(nèi)層壁材的添加對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊的腸溶性沒有較大影響，不會(huì)對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊在腸道中釋放活菌起限制作用。

2.1.4 冷凍干燥對(duì)不同內(nèi)層壁材副干酪乳桿菌微膠囊的活菌數(shù)的影響 冷凍干燥對(duì)副干酪乳桿菌的損害性較大，適當(dāng)?shù)膬?nèi)層壁材對(duì)冷凍干燥微膠囊中的副干酪乳桿菌有一定的保護(hù)作用。由圖3可知，不同內(nèi)層壁材制備的副干酪乳桿菌微膠囊經(jīng)冷凍干燥后，副干酪乳桿菌的活菌數(shù)下降明顯，約為1.5至2個(gè)數(shù)量級(jí)，但存活率明顯優(yōu)對(duì)照組。其中SPI作為內(nèi)層壁材凍干保護(hù)效果最好，其次為WPI、RPI、多孔淀粉、糊精、明膠。

由圖4可知，內(nèi)層壁材對(duì)改善冷藏過程中凍干微膠囊的活菌存活率有明顯改善。其中SPI效果最好，4℃儲(chǔ)存28 d存活率為34.67%，其次為 WPI(31.55%)、RPI(26.88%);PI作為內(nèi)層壁材對(duì)副干酪乳桿菌的保護(hù)效果明顯優(yōu)于糊精(24.57%)、多孔淀粉(23.21%)和明膠(20.16%)，對(duì)照組的存活率僅為21.04%。此外，冷凍干燥后處理的微膠囊冷藏存活率要優(yōu)于未經(jīng)冷凍干燥的樣品，因此采用冷凍干燥工藝處理對(duì)于提高微膠囊中副干酪乳桿菌的存活率，延長微膠囊的儲(chǔ)存期是必要的。

表3 不同內(nèi)層壁材微膠囊中的副干酪乳桿菌在人工胃液中的存活率Table 3 Effect of inner wall materials on survival rate of microcapsule in artificial gastric juice

圖2 不同內(nèi)層壁材微膠囊中的副干酪乳桿菌在人工腸液中的釋放情況Figure 2 Effect of inner wall materials on releasing rate of microcapsule in artifical intestinal juice

圖3 冷凍干燥對(duì)不同內(nèi)層壁材副干酪乳桿菌微膠囊的活菌數(shù)的影響Figure 3 Effect of freeze drying on the viability of microencapsulated Lactobacillus paracasei by different inner wall materials

2.2 副干酪乳桿菌微膠囊外層壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

2.2.1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊的影響

在內(nèi)層壁材SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、CaCl2濃度0.1 moL/L的條件下，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊包埋產(chǎn)率及包埋效率的影響見表4。由表4可知，擠壓法制備微膠囊的包埋產(chǎn)率和包埋效率隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加(1% ～3%)而增大。但當(dāng)海藻酸鈉為4%時(shí)，包埋產(chǎn)率和包埋效率略有降低，這可能因?yàn)楹Ｔ逅徕c濃度過大導(dǎo)致體系黏度過大，不利于菌體分散且不易被擠出從而造成部分菌體損失［8］。此外，隨海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，副干酪乳桿菌微膠囊的粒徑逐漸增大，而且導(dǎo)致微膠囊擠出困難伴隨拖尾現(xiàn)象，因此外形變得不規(guī)則。綜合考慮海藻酸鈉濃度以2%為宜。

圖4 不同壁材副干酪乳桿菌微膠囊冷凍干燥后4℃儲(chǔ)存活菌數(shù)與儲(chǔ)存時(shí)間的關(guān)系Figure 4 Viability of Lactobacillus paracasei in freeze drying microencapsulation with various inner wall materials after 28 days storage under 4℃

表4 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊包埋產(chǎn)率及包埋效率的影響Table 4 Effect of sodium alginate concentrations on yield and efficiency of microencapsules %

2.2.2 氯化鈣濃度對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊的影響 在內(nèi)層壁材SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、CaCl2濃度分別為 0.1，0.2，0.3，0.4 mol/L 的條件下擠壓法制備副干酪乳桿菌微膠囊，CaCl2濃度對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊包埋產(chǎn)率及包埋效率的影響見表5。由表5可知，微膠囊的包埋產(chǎn)率和包埋效率隨著CaCl2濃度的增大隨之增大，原因是體系中Ca2+含量增加可與海藻酸鈉結(jié)合形成了更緊密的凝膠結(jié)構(gòu)。CaCl2濃度為0.2 mol/L時(shí)，對(duì)應(yīng)微膠囊的包埋效率最高，CaCl2濃度為0.3 mol/L時(shí)，包埋產(chǎn)率最高。這應(yīng)是因?yàn)楹Ｔ逅峤Y(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，已沒有多余空間與過多的Ca2+結(jié)合。而且過量的CaCl2不但不會(huì)進(jìn)一步增加微膠囊產(chǎn)率，反而會(huì)增加溶液表面張力和密度，使擠壓出的液滴浮于表面不易成珠［9］。另外，CaCl2濃度為0.2 mol/L制備的副干酪乳桿菌微膠囊經(jīng)冷凍干燥后存活率最高，最終確定適宜的CaCl2濃度為 0.2 mol/L。

表5 CaCl2濃度對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊包埋產(chǎn)率及包埋效率的影響Table 5 Effect of CaCl2concentrations on yield and efficiency of microencapsules

2.3 糖類保護(hù)劑對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊凍干后儲(chǔ)存存活率的影響

副干酪乳桿菌微膠囊凍干過程中有近2個(gè)數(shù)量級(jí)的活菌損失，其最主要原因是干燥前的凍結(jié)處理產(chǎn)生冰晶造成細(xì)胞機(jī)械損傷［10］，干燥處理時(shí)引起的溶質(zhì)損傷和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、功能及成分的變化等［11，12］是冷凍干燥導(dǎo)致大量副干酪乳桿菌死亡的重要原因。通過在冷凍干燥前添加多羥基化合物等保護(hù)劑可有效減少冷凍干燥對(duì)乳酸菌的損害從而提高存活率。綜合糖類成本低廉、經(jīng)濟(jì)易得及部分低聚糖對(duì)特定乳酸菌具有選擇性增殖作用等因素，試驗(yàn)探討了不同糖類保護(hù)劑對(duì)冷凍干燥微膠囊中副干酪乳桿菌的保護(hù)效果。5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的保護(hù)劑(海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、低聚異麥芽糖、低聚果糖或大豆低聚糖)與菌懸液1︰1(V︰V)比例混合，在內(nèi)層壁材SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，CaCl2濃度為0.2 moL/L的條件下制備的副干酪乳桿菌微膠囊經(jīng)冷凍干燥后在4℃儲(chǔ)存28 d，活菌數(shù)的變化見圖5。由圖5可知，效果最好的是低聚異麥芽糖，副干酪乳桿菌4℃、28 d存儲(chǔ)存活率為58.97%。其次為海藻糖(48.86%)，乳糖(46.18%)、大豆低聚糖(34.28%)、低聚果糖(33.53%)次之，葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等雖有一定效果但不十分明顯。低聚異麥芽糖的超強(qiáng)保護(hù)效果原因還不清楚，可能與其對(duì)副干酪乳桿菌較強(qiáng)的增殖作用有關(guān)。

圖5 不同糖類保護(hù)劑對(duì)副干酪乳桿菌微膠囊冷凍干燥后4℃儲(chǔ)存活菌數(shù)與儲(chǔ)存時(shí)間的關(guān)系Figure 5 Effect of saccharides protectants on the viability of microencapsulated Lactobacillus paracasei for 28 days storage under 4℃

3 結(jié)論

擠壓法制備副干酪乳桿菌微膠囊是可行的，SPI作為適宜的內(nèi)層壁材對(duì)于提高微膠囊效率、產(chǎn)率及改善副干酪乳桿菌冷凍存活率和胃腸環(huán)境耐受性是有益的。低聚異麥芽糖的保護(hù)下可以進(jìn)一步改善微膠囊產(chǎn)品的穩(wěn)定性。通過適當(dāng)?shù)陌窆に噧?yōu)化，擠壓法有希望成為副干酪乳桿菌工業(yè)化微膠囊生產(chǎn)方法。

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