陳幸鶯

(湘潭市食品藥品檢驗所，湖南湘潭 411100)

食品防腐劑能抑制食品中微生物的繁殖，防止腐敗變質(zhì)，延長保存期。但是食品中防腐劑的使用存在超范圍、超量使用問題，更有少數(shù)不法之徒為牟取暴利，使用工業(yè)用防腐物質(zhì)作為食品防腐劑，嚴重侵犯了消費者的健康權(quán)益。

食品中食品添加劑丙酸、富馬酸二甲酯、山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸酯類的檢測方法，已有相應(yīng)的單獨測定食品中某一種或多種防腐劑的標準方法。中國國家標準測定食品中丙酸鈣(鈉)［1］、山梨酸、苯甲酸［2］、脫氫乙酸［3］及對羥基苯甲酸酯類［4］的檢測方法中，丙酸是用水蒸氣蒸餾，山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸用乙醚提取，濃縮后以丙酮定容，對羥基本甲酸酯類是以乙醚提取，濃縮后以乙醇定容。湖南省地方標準［5］是采用氣相色譜方法測定食品中富馬酸二甲酯的，高楊［6］、曹淑瑞等［7－9］在采用氣質(zhì)法、液相法測定多種對羥基苯甲酸酯的研究中，對于此12種防腐劑的提取，分別使用了乙醚、丙酮、乙醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑及不同的提取方式。可見，尚無一次性同時檢測以上12種防腐劑的方法。本研究旨在通過簡化、優(yōu)化多種防腐劑的提取方法，探索氣相色譜法一次性同時測定食品中丙酸、富馬酸二甲酯、山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸異丁酯、對羥基苯甲酸庚酯12種防腐劑含量的準確、可靠、快速、簡便的分析方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

乙酸乙酯:色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;

無水硫酸鎂:分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，于馬弗爐700℃灼燒5 h，置于干燥器中備用;

鹽酸溶液:1+1(V/V);

乙酸鋅溶液:200 g/L;

亞鐵氰化鉀溶液:106 g/L;

12種防腐劑標準品:純度大于或等于98.5%，國家標準物質(zhì)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀:GC2010型，配氫火焰離子化檢測器(FID)，日本島津公司;

超聲波清洗器:KQ-500B型，西安精大檢測設(shè)備有限公司;

渦旋混合器:SK-1型，金壇市天竟實驗儀器廠;

離心機:H1850R型，湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 氣相色譜測定條件的優(yōu)化

(1)色譜柱的選擇:DB-1石英毛細管柱，30 m×0.25 mm ×0.25 μm;DB-5 石英毛細管柱，30 m ×0.25 mm ×0.25 μm;DB-FFAP 石英毛細管柱，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm。

(2)柱溫的選擇:恒溫:165℃［3］;程序升溫:100℃(0.5 min)→15℃/min→240℃(28 min);80℃(0.5 min)→15℃/min→240℃(28 min)。

(3)其他色譜條件:進樣口溫度:250℃;檢測器溫度:250 ℃;載氣:氮氣，純度≥99.999%，柱流量:1.0 mL/min;空氣流量:400 mL/min;氫氣流量:47 mL/min;尾吹氣流量:30 mL/min;進樣量:1 μL;進樣方式:分流進樣，分流比:5︰1。

1.3.2 標準溶液的配制 分別準確稱取各防腐劑標準品適量，用乙酸乙酯溶解，配成濃度為10 mg/mL的標準儲備液置于棕色容量瓶中，用刻度吸管準確量取各標準儲備溶液，用乙酸乙酯配成混合標準儲備溶液，濃度為1.0 mg/mL。將混合標準儲備溶液用乙酸乙酯稀釋成 1.28，6.40，16.00，40.00，80.00，100.00，200.00，500 μg/mL 的濃度作為混合標準工作溶液。

1.3.3 不同提取溶劑的試驗 取勻質(zhì)后的待測樣品(10.00±0.01)g于100 mL比色管中，加20 mL水(含蛋白質(zhì)的物質(zhì)，加5 mL乙酸鋅溶液，5 mL亞鐵氰化鉀溶液)，加1 mL鹽酸溶液(1+1)，分別加入10 mL乙醚、丙酮、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑對不同食品樣品中的12種防腐劑進行提取。提取液渦旋2 min，超聲20 min。轉(zhuǎn)入50 mL離心管，以5 000 r/min離心10 min，取上清液至10 mL比色管中，加0.5 g無水硫酸鎂，渦旋2 min，過0.45 μm 有機相濾膜。

1.3.4 不同提取方式的試驗 分別采用超聲波2，5，10，15，20 min，渦旋萃取 2，5，10，15，20 min，渦旋 2 min+ 超聲波 20 min提取3種提取方式，分別測定添加在醬油樣品中的12種防腐劑含量，以考察不同提取方式的提取效率。

1.4 精確度、線性、檢出限及回收率

(1)分別對面包、飲料、醬、醬油、食用檳榔、果汁等食品樣品中的12種防腐劑待測組分進行6平行測定，計算檢測結(jié)果的實驗室內(nèi)變異系數(shù)。

(2)在1.0～1 000.0 μg/mL 的范圍內(nèi)，對12種防腐劑標準物質(zhì)，選取多個濃度進行測定，計算每一種防腐劑標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)。

(3)以儀器測量時的3倍信噪比，測得方法最低檢出限。

(4)對于食品防腐劑含量為0.1～0.4 g/kg的醬油、飲料、糕點、醬、食用檳榔等樣品，違禁物質(zhì)——富馬酸二甲酯(本試驗添加)含量為1～3 mg/kg的食用檳榔、醬油等樣品，分別添加為0.5～4.0 mg的標準物質(zhì)，來測定有效待測組分的回收率。

1.5 方法的驗證

以文獻［1］中方法分別對不同食品樣品中的丙酸組分進行測定;以文獻［5］中方法分別對不同食品樣品中的富馬酸二甲酯組分進行測定;以文獻［10］、［11］中方法相組合，分別對面包、辣椒醬、醬油、果汁等食品樣品中山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸等3種組分進行測定;以文獻［4］中方法分別對不同食品樣品中對羥基苯甲酸酯類等組分進行測定，驗證本試驗方法的準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

以非極性柱 DB-1、中等極性柱 DB-5、極性柱DB-FFAP來檢測分離此12種防腐劑。試驗顯示，DB-1和DB-5柱檢測時，丙酸標準品與溶劑峰出峰時間接近，樣品檢測時不能有效分離，而DB-FFAP柱同時檢測12種防腐劑組分時，能取得滿意的分離效果。DB-1和DB-5柱可用于除丙酸外的其他11種防腐劑的分離檢驗，但被測組分的出峰順序與DBFFAP柱有所不同。

當色譜柱溫度為恒溫分析時不能有效分離丙酸和富馬酸二甲酯、對羥基苯甲酸異丙酯和對羥基苯甲酸甲酯組分，且出峰拖尾嚴重，影響檢測結(jié)果的準確性。當程序升溫的初始溫度高于100℃時，丙酸和富馬酸二甲酯組分不能有效分離的問題同樣存在。當選擇柱溫條件為:80℃(0.5 min)→15℃/min→240℃(28 min)時，對標準物質(zhì)和樣品進行測定，12種防腐劑的分離度好、峰面積大(標準品的色譜圖及部分檢測樣品的色譜圖見圖1～3)。

圖1 12種防腐劑標準品(各單品種0.08 μg)氣相色譜圖Figure 1 Twelve kinds of preservatives standard material(0.08 μg each single variety)by gas chromatogram

圖2 辣椒醬樣品防腐劑檢測氣相色譜圖Figure 2 Chili sauce sample preservatives test by gas chromatogram

圖3 食用檳榔樣品防腐劑檢測氣相色譜圖Figure 3 Edible betel nut samples preservatives test by gas chromatogram

2.2 提取溶劑對食品中12種防腐劑提取效率的影響

因乙醇的親水性，本試驗將其排除在外。本試驗采用乙醚、丙酮、乙腈、乙酸乙酯等試劑進行提取。結(jié)果(表1)表明，采用乙醚、乙腈、乙酸乙酯浸提12種防腐劑的效果都不錯。3種溶劑相比較而言，乙醚沸點低、穩(wěn)定性較差，乙腈毒性較大，費用較高，乙酸乙酯毒性較低、穩(wěn)定性較好，費用較低，綜合考慮，本試驗選擇了乙酸乙酯作為浸提溶劑。

2.3 提取方式對食品中12種防腐劑提取效率的影響

在檢測山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸酯類的標準方法［1－4］中，均是以多次浸提、合并提取液后濃縮的方式進行有效待測組分的提取。在檢測富馬酸二甲酯的標準方法［5］中，是以固相萃取的方式進行有效待測組分的提取。本試驗進行的超聲波提取、渦旋萃取單因素試驗結(jié)果表明，在提取初期(0～2 min)時，渦旋提取比超聲波提取效果要好。隨著提取時間的增加，兩種提取方式的有效待測組分提取率都隨之升高，但超聲波提取的效果更明顯。當提取時間達到20 min之后，兩種提取方式對防腐劑提取效率到達最大值，檢測結(jié)果無顯著性差異。采用渦旋2 min+超聲20 min的組合提取方式進行相同樣品的提取測定(見表2)，結(jié)果顯示，以超聲波渦旋混合提取方式來進行提取的效果最優(yōu)。

2.4 方法的精確度、線性、檢出限及回收率

2.4.1 精密度 本試驗按每種防腐劑各取一種食品樣品進行6次平行測定(見表3)，結(jié)果表明:12種防腐劑平行測定的實驗室內(nèi)變異系數(shù)符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》(GB/T 27404—2008)附錄F要求的含量為1～10 mg/kg樣品的變異系數(shù)≤7.5%;含量為100～1 000 mg/kg樣品的變異系數(shù)≤3.8%的要求，表明本試驗方法重現(xiàn)性良好。

2.4.2 方法的線性范圍 選取 1.28，6.40，16.00，40.00，80.00，100.00，200.00，500.00，1 000.00 μg/mL濃度的12種防腐劑混合標準溶液進行氣相色譜測定，12種防腐劑的線性相關(guān)系數(shù)R均在0.999 9以上(見表4)，符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》(GB/T 27404—2008)附錄F要求的相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99的要求，線性關(guān)系良好。

表1 不同溶劑提取的效果Table 1 Effect of different solvents extraction (g·kg－1)

表2 提取方式對醬油中防腐劑提取效果的影響Table 2 Effect of extraction way on the extraction efficiency of the preservatives in the soy sauce (g·kg－1)

表3 平行測定的實驗室內(nèi)變異系數(shù)Table 3 Parallel determination of the coefficient of variation in the laboratory

2.4.3 方法檢出限 根據(jù)3倍信噪比，測得12種防腐劑的最低檢出限(見表5)，與國家標準、地方標準的相當。

2.4.4 方法的回收率 本試驗選取面包、醬油、食用檳榔、飲料、辣椒醬、腐乳等食品樣品進行了加標回收試驗，測得12種防腐劑回收率在92.1% ～108.3%(見表6)，符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》(GB/T 27404—2008)附錄F要求的被測組分含量為1～100 mg/kg樣品的回收率范圍為90% ～110%;被測組分含量為大于100 mg/kg樣品的回收率范圍為95%～105%的要求，說明本試驗方法的測定結(jié)果準確可靠。

2.5 方法的驗證

采用本法與《食品中丙酸鈉、丙酸鈣的測定》(GB/T 5009.120—2003)兩種方法分別對不同樣品如面包、蛋黃派、醬油、醋等樣品中丙酸含量進行測定，比對結(jié)果見表7，相對偏差符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》(GB/T 27404—2008)附錄F要求的含量為10～1 000mg/kg樣品的檢測結(jié)果偏差范圍為＜15%的要求。

表4 各組分線性范圍Table 4 The linear range of matter

表4 各組分線性范圍Table 4 The linear range of matter

各組分線性范圍均為1～1 000 μg/mL。

防腐劑種類 線性方程 相關(guān)系數(shù)丙酸 y=1 714.0x－7 009.6 0.999 9－2 429.4 0.999 9富馬酸二甲酯 y=1 613.5x－1 305.9 0.999 9山梨酸 y=2 398.6x－8 365.1 0.999 9苯甲酸 y=2 383.1x－8 059.1 0.999 9脫氫乙酸 y=1 619.8x－5 384.8 0.999 9對羥基苯甲酸甲酯 y=2 517.2x－4 893.9 0.999 9對羥基苯甲酸乙酯 y=2 251.8x－5 286.0 0.999 9對羥基苯甲酸異丙酯 y=2 627.6x－6 359.8 0.999 9對羥基苯甲酸丙酯 y=2 677.4x－6 464.4 0.999 9對羥基苯甲酸異丁酯 y=2 814.1x－6 989.3 0.999 9對羥基苯甲酸丁酯 y=2 677.4x－6 822.8 0.999 9對羥基苯甲酸庚酯 y=2 490.1x

表5 方法的最低檢出限Table 5 The minimum detection limit of the method (mg·kg－1)

表6 方法的回收率Table 6 Recoveries of the method

表7 食品中丙酸本法與國標方法測定的比對結(jié)果Table 7 Results compared of the method with national standard method of propionic acid in food

采用本法與《食品中富馬酸二甲酯測定氣相色譜法》(DB43/T 353—2007)兩種方法分別對不同樣品如食用檳榔、醬油、果汁、熟食等樣品中富馬酸二甲酯含量進行測定，比對結(jié)果見表8，相對偏差符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》(GB/T 27404—2008)附錄 F要求的含量為0.01～10.00 mg/kg樣品的檢測結(jié)果偏差范圍為－20% ～+10%的要求。

表8 食品中富馬酸二甲酯本法與地標方法測定的比對結(jié)果Table 8 Results compared of the method with local standard method of dimethyl fumarate in food

采用《食品中脫氫乙酸的測定》(GB/T 23377—2009)、《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定高效液相色譜法》(GB/T 23495—2009)相結(jié)合與本法分別對面包、辣椒醬、醬油、果汁中山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸含量進行測定，比對結(jié)果見表9。相對偏差符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》(GB/T27404—2008)附錄F要求的含量為10～1 000 mg/kg樣品的檢測結(jié)果偏差范圍為＜15%的要求。

表9 食品中山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸本法與國家標準液相色譜法測定的比對結(jié)果Table 9 Results compared of the method with national standard method(HPLC)of sorbic acid，benzoic acid and dehydroacetic acid in food

表10 本法與國標法測定食品中對羥基苯甲酸酯類的比對結(jié)果Table 10 Results compared of the method with national standard method of p-hydroxy benzoic acid esters in food

采用《食品中對羥基苯甲酸酯類的測定》(GB/T 5009.31—2003)與本法分別對食用檳榔、醬油、果汁、果醬中對羥基苯甲酸酯的含量進行測定，比對結(jié)果見表10。相對偏差符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》(GB/T 27404—2008)附錄F的要求。

3 結(jié)論

本試驗建立了采用氣相色譜儀一次性同時檢測12種食品中防腐劑的檢驗方法。該方法選擇了毒性較低、穩(wěn)定性較好，費用較低的乙酸乙酯作為溶劑。通過渦旋提取2 min、超聲波提取20 min，待測組分提取完全，分離度好，靈敏度高、干擾少，具有操作簡便、效率高、能耗低、時間短等優(yōu)點，解決了多種防腐劑提取過程過于繁雜的問題，并采用毛細管柱和程序升溫進行氣相色譜分離測定。本方法的回收率為92.1% ～108.3%，平均回收率 98.5%，回收率標準偏差 3.0%，測定結(jié)果準確可靠。通過與標準方法規(guī)定的氣相色譜方法、液相色譜方法進行比對，結(jié)果偏差符合方法學(xué)要求。

1 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5009.120—2003食品中丙酸鈉、丙酸鈣的測定［S］.北京:中國標準出版社，2011.

2 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5009.29—2003食品中山梨酸、苯甲酸的測定［S］.北京:中國標準出版社，2003.

3 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5009.121—2003食品中脫氫乙酸的測定［S］.北京:中國標準出版社，2003.

4 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5009.31—2003食品中對羥基苯甲酸酯類的測定［S］.北京:中國標準出版社，2003.

5 湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.DB43/T 353—2007食品中富馬酸二甲酯測定氣相色譜法［S］.長沙:湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，2007.

6 高楊，鄭玉山.氣相色譜法及氣相色譜—質(zhì)譜法測定調(diào)味品中的對羥基苯甲酸酯［J］.中國調(diào)味品，2014，39(8):106 ～108.

7 曹淑瑞，劉治勇，張雷，等.高效液相色譜法同時測定食品中6種對羥基苯甲酸酯［J］.分析化學(xué)，2012，40(4):529 ～533.

8 王祖翔，周洪斌，蔣俊，等.氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定復(fù)合調(diào)味料中的微量苯甲酸［J］.食品與機械，2011，27(3):84 ～87.

9 陳利國，曹小彥，黃輝，等.毛細管氣相色譜法直接測定食品中4種對羥基苯甲酸酯［J］.食品與機械，2010，26(1):67 ～69.

10 青島市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.GB/T 23377－2009食品中脫氫乙酸的測定 高效液相色譜法［S］.北京:中國標準出版社，2009.

11 中國標準化研究院.GB/T 23495－2009食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定［S］.北京:中國標準出版社，2009.