郭 哲，王瑞峰，孟憲紅，周 婷，韓繼武

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院消化內科，黑龍江 哈爾濱150001

食管癌指食管上皮組織異常增生形成的一種惡性腫瘤，是目前我國以至世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，且近些年逐漸呈高發(fā)趨勢，早期食管癌手術切除療效好，但多半患者確診時已發(fā)展至癌癥中期甚至晚期，早已失去手術治愈的可能，只能采用放、化療治療，這兩種方法在殺傷癌細胞的同時，還會引起正常組織細胞的損傷，甚至導致嚴重的并發(fā)癥，很多患者不能耐受。近年來隨著內鏡介入治療的發(fā)展，光動力療法(photodynamic therapy，PDT)越來越多地被用于胃腸道腫瘤的治療中，血卟啉單甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether，HMME)作為一種新型的光敏劑被廣泛應用于臨床實驗研究。HMME 是第二代卟啉光動力治療藥物，具有價格低廉、體內迅速代謝、結構明確、光敏效應強、腫瘤攝入率高、靶向性強、毒性低等優(yōu)點。由于PDT 的多樣性及光敏劑種類的不同，于臨床實踐中，血卟啉單甲醚介導的光動力治療(HMME-PDT)對于食管癌治療的具體效果暫不明確。本實驗通過研究HMME-PDT 對裸鼠人食管癌種植瘤的作用，為臨床HMME-PDT 治療人腫瘤細胞提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌ECA-109 細胞株由哈爾濱醫(yī)科大學藥學中心細胞庫提供;HMME 為凍干粉劑，購自上海先鋒醫(yī)藥有限公司，SPF 級裸小鼠，4 ～6 周齡，體質量16 ～18 g，雄雌兼用，由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，飼養(yǎng)于SPF 級動物養(yǎng)殖中心;CO2恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、LXJ-Ⅱ離心沉淀機、生物倒置顯微鏡等均由哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院實驗室提供;半導體激光器(630 nm)由哈爾濱工業(yè)大學提供。

1.2 方法

1.2. 1 細胞培養(yǎng):人食管癌ECA-109 細胞株，于37 ℃、5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，用含EDTA 的0.25%胰酶常規(guī)消化傳代，每3 d 傳代1 次，當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶70%～80%，取進入對數(shù)期生長的細胞用于實驗。

1.2.2 裸小鼠人食管癌移植瘤模型的建立:收集經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)進入對數(shù)期生長的ECA-109 人食管癌細胞，并采用臺盼藍拒染活細胞計數(shù)法計數(shù)，保證活細胞率＞99%，無血清HMME 培養(yǎng)液離心洗滌3 次，去除培養(yǎng)液中的血清。并以無血清HMME 培養(yǎng)液稀釋細胞至109個/ml，在超凈工作臺內按照無菌手術原則操作，將裸小鼠四肢固定后，種植部位均選裸鼠右側腋窩上部，局部消毒后，4#針經(jīng)皮穿刺，于皮下緩慢注入ECA-109 細胞懸液0.2 ml(含細胞約1 ×108個)，術后繼續(xù)在SPF 級飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，每3 d 用游標卡尺測量腫瘤大小，當腫瘤直徑長至0.6 ～0.8 cm，體積0.150 ～0.200 cm3時開始治療。腫瘤體積計算公式:V =ab2π/6(a:腫瘤結節(jié)最大直徑;b:腫瘤結節(jié)最小直徑)。1.2.3 裸鼠人食管癌移植瘤的PDT 治療:將腫瘤體積達到規(guī)定大小的裸鼠隨機分為4 組，每組10 只。A組:荷瘤對照組(不注射HMME，不激光照射);B 組:單純HMME 組(按20 mg/kg 體質量靜脈注射無血清DMEM 培養(yǎng)液配制的HMME 溶液，不進行光照);C組:單純激光組(給予波長630 nm 的激光輻照，能量密度為4 J/cm2，不注射HMME);D 組:HMME-PDT 治療組(按20 mg/kg 體質量腹腔注射無血清DMEM 培養(yǎng)液配制的HMME 溶液，于暗室光敏化2 h 后給予波長為630 nm 的激光輻照，能量密度為4 J/cm2。分別于各組處理后第1、3、7、14、21 天用游標卡尺測量每一個腫瘤大小，并重復測量3 次，按上述公式計算腫瘤體積算出平均腫瘤體積。

1.2.4 病理學檢查:上述各組荷瘤裸鼠治療后被處死，迅速取出瘤體并剖開經(jīng)10%甲醛液固定，制成石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下進行病理形態(tài)學觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)用±s 表示，組間比較采用單因素方差分析和非參數(shù)的t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠人食管癌移植瘤的生長情況 裸鼠接受ECA-109 人食管癌細胞種植后，于10 d 左右可形成種植瘤，直徑0.2 ～0.3 cm，可見背部局部隆起，呈不規(guī)則球形，約3 周時間瘤體直徑長至0.6 ～0.8 cm，腫瘤體積0.150 ～0.200 cm3(見圖1)。

圖1 裸鼠人食管癌種植瘤的生長曲線Fig 1 Growth curve of human esophagus cancer xenografts in nude mice

2.2 裸鼠人胃癌移植瘤的PDT A、B、C 三組裸鼠的一般情況逐漸變差，后期因腫瘤體積增大而導致其行動遲緩，D 組腫瘤體積增長速度較其他三組明顯減緩。經(jīng)PDT 治療后腫瘤表面可見充血、發(fā)紅，而C 組出現(xiàn)暫時的皮膚輕度充血，A、B 組無明顯變化。

重復測量數(shù)據(jù)方差分析顯示4 組間腫瘤體積比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，A、B、C 三組之間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，D 組與A、B、C任一組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01，見表1)。D 組平均生存期達35 d，而A、B、C 三組平均生存時間只有24 d。

表1 四組裸鼠不同時間的平均腫瘤體積(±s)Tab 1 The mean tumor volumes of nude mice at different times in four groups (±s)

表1 四組裸鼠不同時間的平均腫瘤體積(±s)Tab 1 The mean tumor volumes of nude mice at different times in four groups (±s)

注:與D 組比較，* p ＜0.07。

A 組 10 0.189 ±0.006* 0.294 ±0.007* 0.414 ±0.011* 1.112 ±0.021* 1.615 ±0.036*B 組 10 0.185 ±0.012* 0.289 ±0.009* 0.406 ±0.008* 1.090 ±0.021* 1.602 ±0.028*C 組 10 0.183 ±0.008* 0.286 ±0.009* 0.408 ±0.006* 1.113 ±0.038* 1.616 ±0.036*D 組 10 0.182 ±0.011 0.186 ±0.007 0.220 ±0.008 0.34 8 ±0.003 0.522 ±0.024

2.3 病理學檢查 種植瘤組織切片HE 染色鏡檢:可見癌細胞形成癌巢，中央為環(huán)狀紅染的角化物，稱角化珠。細胞異型性明顯，多可見核分裂像。A、B、C 三組治療后腫瘤組織HE 染色鏡檢較治療前無明顯變化。D 組治療后腫瘤組織HE 染色鏡檢:腫瘤組織內細胞大片凝固性壞死，細胞明顯變性和細胞膜受損、破裂，細胞內容物外溢，胞核固縮(見圖2)。

圖2 HMME-PDT 治療前后腫瘤組織病理圖片(HE 100 ×)A:治療前;B:治療后Fig 2 The pathology picture of tumor tissue before and after HMME-PDT treatment(HE 100 ×)A:before treatment;B:after treatment

3 討論

目前食管癌在我國的發(fā)病率居于世界前列，且90%為鱗狀細胞癌。多半患者確診時已是癌癥中期甚至晚期，手術切除及放、化療效果均不好，因此，迫切需要找出一種創(chuàng)傷小、副作用少的治療手段應用于中晚期癌癥患者的姑息治療。PDT 是指光敏劑(Photosensi tizer)通過靜脈注射到患者體內后，在一段時間內光敏劑會被腫瘤組織特異性吸收并相對高濃度地聚集在其中，然后在避光的條件下，用一定波長的激光照射腫瘤組織，在分子氧的參與下，在腫瘤組織內引發(fā)一系列光化學反應，生成具備細胞毒性的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，進一步對生物大分子(氨基酸、腺苷、脂肪酸等)產(chǎn)生氧化作用，殺死腫瘤細胞，并在很大程度上減少對正常細胞的傷害。

PDT 具有以下優(yōu)點:(1)直接下達病變組織部位，不會對周邊正常組織器官產(chǎn)生過多傷害;(2)可以利用內鏡、超聲等方法將激光引入體腔，減少了因手術開體腔而造成的身體創(chuàng)傷;(3)光能利用率比較高，因此使用非常小的光功率便可以達到比較理想的效率;(4)輔助手術治療可以增加療效、降低復發(fā)率，從而提高患者的存活率。且大量實驗證明HMME 可以高濃度地聚集在腫瘤組織表面，而周圍正常組織中一過性吸收或不吸收HMME，且正常組織中HMME 排泄較快，這樣既避免了放、化療給患者帶來的痛苦，又給腫瘤的治療提供了一種新途徑。

自從PDT 應用于臨床以來，已被證實具有較好的臨床療效，由于其創(chuàng)傷小、副作用少，易于被患者接受，據(jù)研究［21-23］對于食管癌的一些癌前病變，PDT 的有效率可高達60%以上。至于HMME-PDT 對人食管癌細胞的具體殺傷機制，目前國內甚至國際尚缺乏有力的探究，僅有相關文獻證實［24］在體外HMME-PDT 對人食管癌ECA-109 具有抑制及殺傷作用，而對于動物實驗領域的作用效果尚缺乏研究。

本實驗研究證明:HMME-PDT 可對人食管癌種植瘤產(chǎn)生一定的抑制作用，一方面體現(xiàn)在經(jīng)HMME-PDT治療后的腫瘤體積與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義，另一方面，這在組織病理學觀察中也得到了證實，PDT治療后腫瘤組織內可見大量死亡細胞，表現(xiàn)為細胞明顯變性和細胞膜受損、破裂;細胞內容物外溢，胞核固縮，并可見到凋亡細胞，這在一定程度上說明了HMME-PDT 對人食管癌ECA-109 具有抑制及殺傷作用，可以為以后HMME-PDT 應用于臨床治療食管癌提供一定的依據(jù)。

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