莫 鳴

江蘇省榮軍醫(yī)院藥劑科，江蘇無錫 214035

腸內(nèi)營養(yǎng)（EN）給藥是經(jīng)口服或管飼提供滿足或補充代謝需要的營養(yǎng)基質(zhì)及其他各種營養(yǎng)素的營養(yǎng)支持方式［1-2］。近年來，營養(yǎng)支持尤其是腸內(nèi)營養(yǎng)支持在各種危重患者的臨床應用中愈加受到重視［3-5］。腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（瑞素）含蛋白質(zhì)、多種水溶性維生素、脂溶性維生素及多種微量元素，其中維生素A就是其中重要的脂溶性維生素之一。通常采用紫外三點校正法測定維生素A含量［6-7］；但復方制劑中由于成分復雜、相互干擾，紫外分光光度法因?qū)傩圆疃鵁o法對復方制劑中的維生素A進行檢測。既往研究顯示，可應用固相萃取高效液相色譜法（HPLC）測定魚肝油乳中維生素A含量［8-10］。但腸內(nèi)營養(yǎng)制劑中富含蛋白質(zhì)，無法固相萃取其中的維生素A。本研究建立了以石油醚（沸程60～90℃）為溶劑的萃取法，并利用反相高效液相色譜法（RPHPLC）測定腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（瑞素）中的維生素A棕櫚酸酯含量，結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

維生素A棕櫚酸酯對照品購自DSM公司（批號為0000018484，含量為1832946IU/g）；腸內(nèi)營養(yǎng)液由華瑞制藥有限公司提供，商品名瑞素（國藥準字：H20020588，批號：80BF105），其處方見表1。甲醇，色譜純，購自Merck公司；石油醚（沸程：60～90℃），分析純，為國藥集團產(chǎn)品；無水乙醇，分析純，購自國藥集團。1100型高效液相色譜儀及其化學工作站購自Agilent公司。

圖1 樣品溶液中維生素A棕櫚酸酯色譜圖

圖2 對照品溶液中維生素A棕櫚酸酯色譜圖

表1 瑞素處方（每1000mL含）

1.2 RP-HPLC測定方法

1.2.1 流動相和色譜條件 選擇Thermo Hypersil ODS C18柱（5μm，4.0mm×250mm）為色譜柱，以甲醇︰水（97︰3，V/V）為流動相，泵流速為2.0mL/min，檢測波長為325nm，進樣量為20μL。

1.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取維生素A棕櫚酸酯對照品15mg，置100mL量瓶中，加石油醚溶解并稀釋至刻度。精密量取1mL置100mL量瓶中，加石油醚稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

1.2.3 樣品溶液的配制 精密稱取瑞素樣品20g（密度為1.068g/mL），加入20mL石油醚中劇烈振搖5min，加入40mL無水乙醇，再振搖3min，放置分層。取上清液為樣品溶液。

1.2.4 維生素A棕櫚酸酯含量測定 分別取對照品溶液和供試品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算獲得維生素A棕櫚酸酯含量［11-12］。

1.2.5 系統(tǒng)適應性試驗 取樣品溶液進樣20μL，在325nm處測定，理論塔板數(shù)為5327，說明柱效較高，完全能滿足本次實驗。利用二極管陣列檢測器和化學工作站，測定維生素A棕櫚酸酯的峰純因子為999.930，說明此峰中無其他未分離組分（圖1）。

1.2.6 專屬性試驗 配制不含維生素A棕櫚酸酯的陰性樣品溶液，同時進樣此樣品溶液和1.2.2中制備的標準對照品溶液，樣品溶液在維生素A棕櫚酸酯處不出峰（圖2）。

表2 線性試驗結(jié)果

表3 重復性試驗結(jié)果

表4 中間精密度試驗結(jié)果

表5 樣品回收率測定

1.2.7 線性試驗 精密稱取維生素A棕櫚酸酯10、15、25、50、100mg，用石油醚（沸程為60～90℃）分別溶解并制成1.00、1.50、2.50、5.00、10.00μg/mL溶液，取20μL進樣，每份進樣2次，以濃度（C）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標計算回歸方程及相關系數(shù)（r）。

1.2.8 重復性試驗 按1.2.3方法制備6份樣品溶液，取樣品溶液20μL進樣，計算樣品溶液中維生素A棕櫚酸酯峰面積與樣品稱重比值的相對標準偏差（RSD）。

1.2.9 中間精密度試驗 采用另外一臺Agilent 1100型高效液相色譜儀，按上述方法測定6次，計算樣品中維生素A棕櫚酸酯峰面積與樣品稱重比值的RSD值。

1.2.10 回收率試驗 稱取維生素A棕櫚酸酯16.5527mg，按1.2.2方法配制標準溶液，精密稱定已知含量的瑞素6份各20g，分別加入20.00mL標準溶液，劇烈振搖5min，加入40.0mL無水乙醇，再振搖3min，取上清液進樣，計算回收率。

2 結(jié)果

以濃度C為橫坐標、峰面積A為縱坐標，計算得到線性回歸方程為A=42.9971C-1.2916，相關系數(shù)r=0.9992（表2），表明維生素A棕櫚酸酯在1.0～10.0μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好。其重復性和中間精密度試驗的RSD為2.0％（n=12），表明重復性和中間精密度好（表3～4）。樣品回收率為99.51％，回收率RSD=1.2％（表5），表明此方法結(jié)果準確。通過陰性樣品試驗和峰純度檢查說明本方法專屬性較好（圖1～2）。

3 討論

腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑（瑞素）為復方制劑，成分復雜、干擾較多，測定時我們先使用石油醚對樣品充分乳化，使得維生素A棕櫚酸酯酯充分分散到石油醚中，然后使用乙醇作為破乳劑將樣品充分震搖而產(chǎn)生破乳，最終使石油醚層與乙醇層迅速分離。對于破乳劑應先確定其是油溶性還是水溶性，水溶性破乳劑用水作為溶劑，油溶性破乳劑通常用甲醇作為溶劑，考慮到甲醇的毒性，采用無毒乙醇作為替代品，收到了良好效果［13-14］。

石油醚的沸程有30～60℃、60～90℃和90～120℃，此數(shù)值是指餾分不同，30～60℃沸程是指其中餾分的初餾點不低于30℃，終餾點不高于60℃，其他依此類推。因此，30～60℃沸程的石油醚最容易揮發(fā)，60～90℃次之，90～120℃相對不易揮發(fā)，但與樣品的乳化能力稍差［15］。我們采取60～90℃沸程的石油醚，其不易揮發(fā)，又有較強和樣品充分乳化的能力，能更好地萃取，故選擇其作為萃取溶劑。

使用石油醚溶解維生素A棕櫚酸酯在紫外分光光度計中掃描，測得其最大吸收波長為325nm［13］，故本實驗采用325nm作為檢測波長。樣品取樣采用稱重而不是體積是為了取樣更準確。因為腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑富含蛋白質(zhì)和脂肪，有一定黏稠度，量取體積會增加實驗誤差。此外，對照品和樣品溶液制備時要盡量避光或在暗光下操作，雖然維生素A棕櫚酸酯的穩(wěn)定性較醋酸酯高，但制備好的溶液仍盡可能快速進樣分析，以防維生素A棕櫚酸酯在溶液中降解［16］。

本研究建立并應用RP-HPLC法測定腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑中的維生素A棕櫚酸酯含量，發(fā)現(xiàn)維生素A棕櫚酸酯在1.0～10.0μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好（r=0.9992），重復性和中間精密度較高（RSD=2.0％）；測定結(jié)果準確，樣品回收率為99.51％，回收率RSD=1.2％；且專屬性較好。本研究結(jié)果表明，RP-HPLC法簡便、快速、準確、精密度好且無干擾，可用于腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑中維生素A棕櫚酸酯含量測定。

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