上皮鈣黏素/連環(huán)素復(fù)合體對大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用的影響

顏建輝1黃麗娟1楊柳1陳雁斌1華力明1

(湘南學(xué)院心腦血管研究所，湖南長沙410000)

摘要〔〕目的探討E-鈣黏素/連環(huán)素(E-cadherin/catenin)復(fù)合體對神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖作用的影響。方法從胎鼠腦組織中分離、培養(yǎng)NSCs，制備細(xì)胞懸液，隨機(jī)分為正常組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組?？寺〈笫驟-cadherin全長于慢病毒(Lentivirus)，轉(zhuǎn)染至實(shí)驗(yàn)1組NSCs；采用siRNA法將E-cadherin對應(yīng)片段克隆進(jìn)入Lentivirus載體，轉(zhuǎn)染至實(shí)驗(yàn)2組。RT-PCR及Western印跡方法檢測各組細(xì)胞E-cadherin、β-catenin、p120-ctn的mRNA及蛋白表達(dá)水平。以MTT法繪制細(xì)胞生長曲線，免疫熒光染色標(biāo)記計(jì)數(shù)Nestin、BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果實(shí)驗(yàn)1組E-cadherin、β-catenin、p120-ctn的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常組，但NSCs增長率及BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)目顯著低于正常組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)2組E-cadherin、β-catenin、p120-ctn的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著低于正常組，但NSCs增長率及Nestin、BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)目均顯著高于正常組(P<0.05)。結(jié)論下調(diào)E-cadherin/catenin復(fù)合體的表達(dá)可能促進(jìn)體外培養(yǎng)的NSCs增殖。

關(guān)鍵詞〔〕E-鈣黏素/連環(huán)素；神經(jīng)干細(xì)胞；慢病毒

中圖分類號〔〕R-36〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

1湘南學(xué)院附屬醫(yī)院

第一作者：顏建輝(1974-)，男，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病變研究。

神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)是一類具有分化為神經(jīng)元細(xì)胞，并能夠提供大量腦組織細(xì)胞能力的干細(xì)胞，因NSCs的自我更新、多向分化潛能的性質(zhì)，被譽(yù)為“萬能細(xì)胞”，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的多種疾病中都有重要的治療價(jià)值。上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)是一種重要的細(xì)胞間黏附分子，參與形成和維護(hù)正常細(xì)胞間的連接〔1〕。E-cadherin功能的發(fā)揮離不開連環(huán)素(catenin)的作用，它可以與α-catenin、β-catenin、γ-catenin及p120-catenin一起組成E-cadherin/catenin 復(fù)合體，在維持上皮細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)完整性和新陳代謝過程中起到重要作用。p120ctn是穩(wěn)定E-cadherin/catenin復(fù)合體的主要成分，最新研究表明，E-cadherin與p120-catenin結(jié)合，可以調(diào)控人胚胎干細(xì)胞的微環(huán)境以及重編程功能〔2〕。在小鼠的胚胎干細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin/β-catenin介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附，同時(shí)可以抑制GSK-3β活性，調(diào)控干細(xì)胞的自我更新活性〔3〕。但是，E-cadherin/catenin復(fù)合體對NSCs的增殖作用鮮有報(bào)道。本課題觀察E-cadherin/catenin復(fù)合體內(nèi)黏附分子變化對移植NSCs的增殖的影響，為提高NSCs移植治療相關(guān)疾病的臨床療效及新藥的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物孕14 d Wistar大鼠1只，由武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2主要試劑多聚賴氨酸、巢蛋白(nestin)、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)、Lipofectamine 2000均由Sigma公司提供； B27復(fù)合物、胎牛血清、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)由北京中杉金橋試劑有限公司提供； DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Trizol試劑盒、RNA 抽提試劑盒、熒光標(biāo)記FITC試劑、DAB顯色劑、SABC免疫組化試劑盒均由武漢子心生物科技有限公司提供；兔抗山羊IgG-Cy3，山羊抗鼠IgG-FITC均由武漢博士德生物有限公司提供；E-cadherin單克隆抗體及p120-catenin抗體均由Abcam公司提供；Lentivirus病毒由上海吉滿生物科技公司提供。

1.3方法

1.3.1NSCs的分離與培養(yǎng)取孕14 d Wistar大鼠，脫臼處死后于無菌條件下取出胎鼠，取出大腦組織D-Hank漂洗后，剪碎，吹打分散制成細(xì)胞懸液，離心，棄上清，置于含有2%B27，20 μg/L bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，3 d后待克隆球形成后，換液，用同樣的方法傳代培養(yǎng)3～4次，收集懸浮神經(jīng)球制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至1×105/ml。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組將上述NSCs單細(xì)胞懸液等分為3份，分別為正常組、實(shí)驗(yàn)1組及實(shí)驗(yàn)2組。正常組不作任何處理，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3E-cadherin克隆及過表達(dá) 克隆大鼠E-cadherin編碼序列全長，表達(dá)于Lentivirus病毒載體，經(jīng)293T細(xì)胞包裝后，收集病毒，轉(zhuǎn)染至實(shí)驗(yàn)2組的NSCs，具體轉(zhuǎn)染步驟按Lipofectamine 2000試劑說明書操作。

1.3.4siRNA-Lentivirus病毒載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則,使用Invitrogen公司siRNA設(shè)計(jì)軟件，載體pGenesil-的酶切位點(diǎn)以及GenBank中大鼠E-cadherin(GenBank accession AB017696.1)的編碼序列，設(shè)計(jì)并合成片段如下：siRNA：5'-AAGATAGGAGTTCTCTGATGC-3' 陰性序列：5'-GGCGUGUCUCUCUUACGAC-3'。序列采用慢病毒(Lentivirus)載體，將對應(yīng)片段克隆進(jìn)入載體，經(jīng)293T細(xì)胞包裝后，收集病毒，轉(zhuǎn)染至實(shí)驗(yàn)1組的NSCs，操作同上。

1.4MTT法測定NSCs的生長曲線取上述各組NSCs懸液，以無血清培養(yǎng)基接種于96孔培養(yǎng)板(細(xì)胞濃度1×104個(gè))，150 μl/孔，觀察記錄細(xì)胞的生長狀況，在每孔加入MTT(5 g/L)20 μl，培養(yǎng)4h，手機(jī)孔內(nèi)細(xì)胞并離心，每孔加入150 μlDMSO，震蕩10 min，并分別于1、2、3、4、5、6和7 d以酶標(biāo)儀自動測定490 nm波長時(shí)OD值。

1.5RT-PCR檢測E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn 的mRNA的表達(dá)Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板行PCR 擴(kuò)增，各基因的引物序列，見表1。PCR 產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳測定擴(kuò)增帶灰度值，得到mRNA的相對表達(dá)量，以β-actin為參照。

表1各基因引物序列及擴(kuò)增片段長度

基因引物序列(5'→3')擴(kuò)增片段長度(bp)E-cadherin正義鏈:TGCCCCAGTATCGTCCCCGT186反義鏈:CGGTTGCCCCATTCGT-TCAGATAAp120-ctn正義鏈:TGCCCTGCTGGATTTGTCTT250反義鏈:CGCTGGGTGTCCTGATGTGCβ-catenin正義鏈:GACTCTGAGAAACTTGTC-CGATGC375反義鏈:CGCTGGGTGTCCTGATGTGCβ-actin正義鏈:GAAATCGTGCGTGACATTAAG665反義鏈:CTAGAAGCATTTGCGGTGGA

1.6Western印跡法檢測E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn的蛋白表達(dá)各組NSCs懸液，裂解、變性后離心，取上清液，以Bradford測定總蛋白量。取10 μg蛋白上樣，采用SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜；然后將膜室溫下封閉2 h，PBS漂洗，分別加入一抗E-cadherin(1∶400)、β-catenin(1∶200)及p120-ctn(1∶400) ，4℃過夜；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗37℃孵育1 h，ECL發(fā)光顯色，以圖像分析系統(tǒng)觀察表達(dá)情況，以β-actin作為對照。

1.7Nestin、BrdU免疫熒光染色及計(jì)數(shù)各組NSCs接種于無菌蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中(預(yù)先包被0.01%多聚賴氨酸)，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集貼壁細(xì)胞制備細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗，加一抗Nestin(1∶200)、BrdU(1∶200)進(jìn)行免疫熒光染色，隨機(jī)觀察100個(gè)視野，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)，并取其平均值。

2結(jié)果

2.1各組E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn的表達(dá)Western印跡和RT-PCR法顯示，實(shí)驗(yàn)1組E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)較正常組則顯著增強(qiáng)(P<0.05)，呈過表達(dá)狀態(tài)，β-catenin 及p120-ctn蛋白及mRNA表達(dá)也顯著增強(qiáng)(P<0.05)；而經(jīng)過siRNA干擾后，實(shí)驗(yàn)2組的E-cadherin的蛋白及mRNA表達(dá)均較正常組顯著減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，β-catenin 及p120-ctn的蛋白及mRNA表達(dá)較正常組也顯著減弱(P<0.05)，見圖1，圖2。

A、B、C：正常組、實(shí)驗(yàn)2組及實(shí)驗(yàn)1組，下圖同 圖1　E-cadherin、β-catenin及p120-ctn的蛋白表達(dá)

圖2　E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn的mRNA表達(dá)

2.2各組NSCs的生長曲線實(shí)驗(yàn)1組的OD值與正常組相比顯著降低(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)2組的OD值則顯著高于正常組及實(shí)驗(yàn)1組(P<0.05)，見圖3。

圖3　各組NSCs的生長情況

2.3免疫熒光測定各組Nestin及BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目BrdU 熒光染色陽性細(xì)胞胞質(zhì)著紅色，Nestin染色陽性細(xì)胞則呈綠色；與正常組相比，實(shí)驗(yàn)1組的Nestin及BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)2組的Nestin及BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目則顯著高于正常組及實(shí)驗(yàn)1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2及圖4，圖5。

組別Nestin陽性細(xì)胞BrdU陽性細(xì)胞正常組43.28±12.4532.15±10.64實(shí)驗(yàn)1組20.07±9.131)14.22±8.931)實(shí)驗(yàn)2組72.63±13.011)2)61.37±11.061)2)

與正常組比較：1)P<0.01；與實(shí)驗(yàn)1組比較：2)P<0.01

正常組　　　　　　實(shí)驗(yàn)1組　　　　　　實(shí)驗(yàn)2組 圖4　BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目(免疫熒光×400)

正常組　　　　　　實(shí)驗(yàn)1組　　　　　　實(shí)驗(yàn)2組 圖5　Nestin陽性細(xì)胞數(shù)目(免疫熒光,×400)

3討論

NSCs能夠生成神經(jīng)組織，在體外能維持未分化狀態(tài)，因其具有多向分化潛能和自我更新能力〔4，5〕，故而NSCs移植為腦損傷修復(fù)以及神經(jīng)性疾病的治療帶來了希望。近年來，隨著人們對影響NSCs增殖的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)微環(huán)境對于干細(xì)胞的自我更新，增殖，分化調(diào)控以及干細(xì)胞遷移和歸巢至關(guān)重要，而微環(huán)境中E-cadherin是其中重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞間連接，可以促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新，且不依賴LIF因子，這表明E-cadherin在干細(xì)胞的自我更新中扮演關(guān)鍵性角色〔6〕。catenin是一類位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)相似的糖蛋白家族,也是E-cadherin最為密切的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黏附相關(guān)蛋白配體，E-cadherin黏附功能的正常發(fā)揮，主要受catenin的調(diào)節(jié)。該家族中主要包括α-catenin、β-catenin、γ-catenin及p120-catenin。當(dāng)胞質(zhì)內(nèi)α-catenin將β-catenin和(或)γ-catenin與細(xì)胞骨架的肌動蛋白微絲相連，而β-catenin和(或)γ-catenin

直接與E-cadherin 的胞質(zhì)區(qū)結(jié)合，即形成了E-cadherin/ catenin 復(fù)合體。該復(fù)合體能將E-cadherin定位于細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸部位，在細(xì)胞間黏附、建立細(xì)胞極性、維持組織形態(tài)中起重要作用。P120ctn 是穩(wěn)定E-cadherin/catenin復(fù)合體的主要成分〔7〕。大量研究表明，腫瘤組織中如果E-cadherin/catenin復(fù)合體出現(xiàn)破壞或丟失的現(xiàn)象,細(xì)胞間黏附將會丟失，有利于惡性細(xì)胞的無限制增生〔8〕。而上皮細(xì)胞內(nèi)E-cadherin過度表達(dá)能抑制細(xì)胞的游走與增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔9〕。因此，推測如果下調(diào)E-cadherin/catenin復(fù)合體的表達(dá)，可能會促進(jìn)體外培養(yǎng)NSCs的增殖。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示隨著E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn表達(dá)的下降，導(dǎo)致E-cadherin與catenin連接受阻，E-cadherin/catenin復(fù)合體與細(xì)胞骨架相互作用減弱，使E-cadherin不能定位于膜上，被胞質(zhì)內(nèi)蛋白酶降解，細(xì)胞的黏附功能障礙，細(xì)胞間連接松散，黏附力下降，有利于傳遞增殖信號導(dǎo)，細(xì)胞分裂增殖能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)了NSCs的增殖。

綜上所述，下調(diào)E-cadherin/catenin復(fù)合體的表達(dá)可能促進(jìn)體外培養(yǎng)的NSCs增殖，為NSCs治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的視點(diǎn)，但是其具體作用機(jī)制尚需要更深入的研究。

4參考文獻(xiàn)

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〔2013-12-07修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)