補體-中性粒細胞反饋的炎癥應答調控在過敏性紫癜中的作用

周貴濱1溫炬1李婷1秦思1

(南方醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院，廣東廣州510630)

摘要〔〕目的探討補體-中性粒細胞反饋的炎癥應答調控在過敏性紫癜(HSP)中的作用機制。方法選取24只清潔級日本大耳白兔為受試對象，分為正常組和模型組，每組12只。以干姜、蓽茇、胡椒水煎劑混合液的藥物灌胃，腹腔注射卵白蛋白-弗氏佐劑、耳緣靜脈和背部皮內(nèi)注射卵白蛋白生理鹽水的方式構建過HSP模型。比較兩組兔的飲食、飲水量、體溫、血液常規(guī)和尿液常規(guī)變化及活性氧自由基(ROS)、炎性因子和補體成分的改變，同時以N-乙酰半胱氨酸(NAC)和過氧化氫(H2O2)干預ROS水平，并觀察上述指標的變化。結果模型組兔在激發(fā)過敏后，體溫明顯升高,精神狀態(tài)萎靡、運動量減少，飲水量和飲食量均較致敏前顯著降低(P<0.05)；而且，血液常規(guī)指標WBC、MCHC、NEU、NEU%水平明顯升高，RBC、HGB、EOS和EOS%含量顯著降低(P<0.05)，而MCH和PLT則無明顯變化(P>0.05)；尿液出現(xiàn)拉絲、氣味大的情況，其中66.67%出現(xiàn)尿蛋白陽性、58.33%出現(xiàn)尿紅細胞、25%尿白細胞陽性；另外，模型組兔的ROS、炎性因子、TGF-β、補體水平也均明顯升高；在ROS抑制劑NAC處理之后，上述指標水平明顯降低(P<0.05)，而在應用ROS激動劑H2O2處理之后，這些指標卻明顯升高(P<0.05)。結論補體-中性粒細胞反饋的炎癥應答調控在HSP的形成中具有重要作用，抑制ROS水平能抑制HSP的發(fā)生和進展。

關鍵詞〔〕過敏性紫癜；補體；中性粒細胞；炎癥應答

中圖分類號〔〕R55〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：溫炬(1966-)，男 ，博士，主任醫(yī)師，教授，主要從事皮膚性病方面的研究。

1南方醫(yī)科大學附屬南粵醫(yī)院廣東省第二人民醫(yī)院皮膚性病科

第一作者：周貴濱(1986-)，男，在讀碩士，主要從事皮膚性病方面的研究。

過敏性紫癜(HSP)又稱許蘭-亨諾紫癜，是一種常見的異質性、炎癥性和自身免疫性皮膚血管炎癥，其主要病理改變?yōu)檎嫫\層的白細胞破碎、血管內(nèi)皮細胞腫脹、中性粒細胞浸潤等〔1〕。HSP多由外界變應原如食物、藥物、細菌感染等多種致病因素的刺激引發(fā)〔2〕，但目前HSP的致病機制仍未闡明。免疫系統(tǒng)異常及免疫-炎癥反應失調被認為是誘發(fā)HSP的主要潛在致病機制〔3，4〕。補體系統(tǒng)是機體抵御病原體入侵的主要效應系統(tǒng)，并且補體-中性粒細胞之間還存在一定的反饋炎癥應答調控機制，即補體活化激活中性粒細胞呼吸爆發(fā)釋放的活性氧自由基能再次活化補體，在補體之間形成相互反饋活化、增強炎癥應答的反應〔5〕。當前，該機制是否參與調控HSP的發(fā)生發(fā)展過程尚不清楚。本研究擬探討補體活化和抑制情況下中性粒細胞介導的炎性反應的應答調控變化，以期為揭示HSP的致病機制提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1試劑與儀器卵白蛋白-弗氏佐劑(均可購自于美國Sigma公司，制作方法：將卵白蛋白溶于0.9%的生理鹽水，20 mg卵白蛋白/ml配制，并以1∶1的比例和弗氏佐劑混合)；白細胞介素(IL)-2，-4，-6，-8、活性氧自由基(ROS)轉化生長因子(TGF)-β和補體成分C3、C4、C5酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購于上海恒遠生物科技有限公司；N-乙酰半胱氨酸(NAC)、過氧化氫(H2O2)，北京索萊寶生物科技有限公司；美國BIORAD酶標儀，型號Model 680；恒溫水浴箱由河北黃驊儀器廠提供；721分光光度計，上海精密科學儀器有限公司，型號16C14型；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗動物的選擇取24只健康清潔級日本大耳白兔〔購自于中山大學動物實驗中心，合格證號：SCXK(粵)2004.001〕，兔齡4月，雌雄各半，體重2.2～3.0 kg。將白兔按照體重隨機編號分為正常組和模型組各12只，雌雄各半。動物飼養(yǎng)于中山大學動物中心，溫度18℃～25℃，相對濕度40%～60%，光暗照明時間各12 h，每籠1只，自由進食和飲水。實驗動物操作經(jīng)動物使用管理委員會批準。

1.3動物模型構建

1.3.1連續(xù)抗原刺激致敏將干姜、蓽茇、胡椒水煎劑(購于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院)用1∶1∶1的比例配置成終濃度為15 g/100 ml的液體溶液，在實驗開始前2 w，正常組兔子每日給予200 g/只普通飼料；模型組兔子在比基礎之上灌胃1 ml上述藥液，每日1次，正常組用等量生理鹽水灌胃，其他條件盡可能保持一致。另外，模型組動物還采取腹腔注射的方式加用卵白蛋白-弗氏佐劑每日1 ml/只，連續(xù)3 w，以達到連續(xù)抗原刺激致敏的目的，正常組動物注射等量生理鹽水。

1.3.2抗原沖擊激發(fā)過敏反應腹腔注射3 w后，模型組動物再通過耳緣靜脈注射0.5 ml濃度為10 mg/ml的卵白蛋白生理鹽水，背部皮膚剪毛，皮下分5個位置點注射0.3%卵白蛋白生理鹽水0.2 ml。在抗原沖擊激發(fā)過敏反應之后，觀察每點皮膚局部紅腫的情況以驗證模型是否構建成功。

1.4一般指標觀察實驗過程中分別對兩組兔子進行一般癥狀觀察：平均每天飲食、飲水量、體溫、血液常規(guī)和尿液常規(guī)；采取考馬斯亮藍法收集動物24 h尿量，并測定24 h尿蛋白。

1.5ROS、炎性因子和補體水平檢測采用ELISA法檢測血清ROS、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、TGF-β和補體C3、C4、C5水平；于96孔酶標板每孔加入稀釋好的標準品，按ELISA試劑盒說明書操作。實驗過程中取對照組和模型組兔各6只(雌雄各3只)，分別采取腹腔注射加用ROS拮抗劑NAC和促進劑H2O2的方式，觀察對兩組兔子血清炎性因子及補體成分的影響。

2結果

2.1兔皮膚外部特征的變化皮下注射之后，兔皮膚注射位置均出現(xiàn)直徑1 cm左右的皮丘。持續(xù)觀察4～8 h之后，正常組兔背部的皮丘逐漸消失，而模型組兔背部的皮丘呈現(xiàn)增大的趨勢，且出現(xiàn)皮膚周圍組織水腫、皮下出血等癥狀。注射結束后24 h，模型組兔背部皮膚均呈現(xiàn)紫色斑塊，形狀不規(guī)則，大小不一，部分紫斑隨時間延長出現(xiàn)結痂或壞死，而正常組兔的皮膚則無明顯改變。

2.2兔體溫、飲食、飲水量的變化正常組兔在致敏前、激發(fā)過敏后的體溫、飲食量和飲水量均無明顯改變(P>0.05)；而模型組兔在激發(fā)過敏后，精神狀態(tài)萎靡、運動量減少，飲水量和飲食量均較致敏前顯著降低(P<0.05)；與正常組相比，模型組兔在激發(fā)過敏后體溫明顯升高(P<0.05)，而進食和飲水量則顯著減少(P<0.05)。見表1。

組別體溫(℃)致敏前激發(fā)過敏后P值飲食量(g)致敏前激發(fā)過敏后P值飲水量(ml)致敏前激發(fā)過敏后P值正常組38.41±0.1938.58±0.18>0.05200.45±10.63197.56±12.78>0.05308.25±22.93319.58±21.45>0.05模型組38.13±0.2239.05±0.24<0.05201.82±12.05163.92±9.84<0.05306.81±20.76286.52±14.93<0.05t/P值1.491/0.2934.591/0.0281.057/0.3145.190/0.0010.985/0.49612.582/<0.001

2.3兔血液、尿液常規(guī)的變化致敏前模型組和正常組血液常規(guī)各項指標比較均無明顯差異(P>0.05)，且激發(fā)過敏后正常組兔的血液常規(guī)指標也無顯著改變(P>0.05)；但模型組兔激發(fā)過敏后，WBC、MCHC、NEU、NEU%水平明顯升高，RBC、HGB、EOS和EOS%含量顯著降低(P<0.05)，而MCH和PLT則無明顯變化(P>0.05)。另外，致敏前正常組和模型組兔的尿液常規(guī)檢測指標均基本正常，激發(fā)過敏后，正常組兔尿液無明顯變化，而模型組兔尿液出現(xiàn)拉絲、氣味大的情況，其中66.67%出現(xiàn)尿蛋白陽性(8只)、58.33%出現(xiàn)尿紅細胞(7只)、25%尿白細胞陽性(3只)，而24 h排尿量、尿糖、尿膽紅素、尿酮體、尿膽原、尿比重和酸堿度則均無明顯變化，24 h尿蛋白從103.25 mg/24 h升高至402.45 mg/24 h(P<0.05)。見表2。

2.4兔ROS、炎性因子和補體水平變化致敏前正常組與模型組的ROS、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、TGF-β、補體C3、C4和C5的水平比較無明顯差別(P>0.05)；激發(fā)過敏后，正常組上述指標未發(fā)生顯著改變，而模型組ROS、炎性因子、TGF-β、補體水平均明顯升高；而且，模型組兔的這些指標水平也明顯高于正常組(P<0.05)。ROS抑制劑NAC處理之后，ROS、炎性因子、TGF-β和補體C3、C4和C5的水平明顯降低(P<0.05)，而應用ROS激動劑H2O2處理之后，上述指標均明顯升高(P<0.05)。見表3。

組別WBC(×1012/L)致敏前激發(fā)過敏后RBC(×1012/L)致敏前激發(fā)過敏后HGB(g/L)致敏前激發(fā)過敏后MCH(fl)致敏前激發(fā)過敏后MCHC(g/L)致敏前激發(fā)過敏后正常組6.81±1.237.20±1.855.55±0.685.93±0.89105.24±7.58104.29±7.0419.45±0.8420.45±0.92275.32±4.98278.49±4.09模型組6.90±1.1822.59±5.681)2)5.61±0.774.09±0.761)2)104.98±8.0492.58±6.451)2)19.08±0.9220.88±0.86274.76±5.32306.82±5.981)2)組別PLT(×109/L)致敏前 激發(fā)過敏后NEU(×109/L)致敏前 激發(fā)過敏后NEU(%)致敏前激發(fā)過敏后EOS(×109/L)致敏前激發(fā)過敏后EOS(%)致敏前激發(fā)過敏后正常組332.45±11.95334.46±10.850.18±0.040.20±0.082.45±0.922.52±0.891.88±0.791.86±0.7627.39±5.2326.93±4.94模型組330.83±12.34335.38±11.240.19±0.060.61±0.131)2)2.53±0.893.15±0.951)2)1.86±0.681.45±0.511)2)27.45±5.5720.48±5.291)2)

與致敏前比較:1)P<0.05；與正常組比較:2)P<0.05

組別ROS(IU/ml)致敏前激發(fā)過敏后IL-2(ng/L)致敏前激發(fā)過敏后IL-4(ng/L)致敏前激發(fā)過敏后IL-6(ng/L)致敏前激發(fā)過敏后IL-8(ng/L)致敏前激發(fā)過敏后正常組478.79±12.45480.22±13.536.28±0.896.50±1.1027.23±6.0328.11±4.877.02±1.357.15±1.2842.38±8.4243.11±7.28模型組482.28±11.29599.54±25.281)2)6.20±1.0215.32±2.351)2)26.96±5.2939.58±7.561)2)6.88±1.2019.55±3.591)2)41.97±7.9260.25±9.411)2)ROS抑制劑組-328.29±10.843)-10.85±2.103)-30.15±4.693)-10.36±2.42-49.27±8.023)ROS促進劑組-682.13±28.493)-19.32±2.683)-46.92±6.023)-25.85±5.01-71.34±10.233)組別TGF-β(IU/ml)致敏前激發(fā)過敏后C3(μg/ml)致敏前激發(fā)過敏后C4(μg/ml)致敏前激發(fā)過敏后C5(μg/ml)致敏前激發(fā)過敏后正常組26.80±5.0827.98±4.8764.51±12.7465.56±10.322.54±0.682.67±0.7336.89±8.2338.32±9.43模型組27.04±4.9750.66±5.211)2)64.90±10.8875.75±14.651)2)2.78±0.767.98±1.031)2)37.03±7.1878.19±11.891)2)ROS抑制劑組-31.58±2.563)-67.59±11.303)-4.32±1.223)-48.30±10.393)ROS促進劑組-60.23±6.293)-85.85±12.393)-10.56±2.483)-89.12±19.023)

與致敏前比較:1)P<0.05；與正常組比較:2)P<0.05；與模型組比較:3)P<0.05

3討論

本研究結果顯示，在HSP模型兔中，炎性因子水平明顯升高，而拮抗機體的ROS水平能夠減弱中性粒細胞介導的炎癥反應應答；并且，在炎癥反應發(fā)生強度較大的情況下，模型兔的血液常規(guī)指標，如WBC、MCHC、NEU、NEU%等水平也出現(xiàn)明顯異常改變以適應機體內(nèi)的炎性應激反應。

目前的普遍觀點認為炎癥性疾病，尤其是在可形成免疫復合物的疾病中(如HSP等)，組織的炎癥損傷反應主要由補體系統(tǒng)的活化所介導〔6，7〕。有研究表明，活化的補體可產(chǎn)生過敏毒，進而對中性粒細胞產(chǎn)生趨化作用，并在細胞松弛素B作用下引起白細胞溶酶體酶釋放〔8〕。動物實驗研究亦證實，抑制補體的活化或清除ROS均可有效緩解動物皮膚動脈血管炎的癥狀。更值得關注的是，補體活化片段還可以趨化中性粒細胞，并激活其發(fā)生級聯(lián)反應，釋放ROS〔9〕。本研究結果也提示補體系統(tǒng)在HSP發(fā)生過程中被活化，更為重要的是，筆者發(fā)現(xiàn)抑制了ROS的水平能夠減弱補體的活化程度，減輕炎癥反應，表明補體-中性粒細胞反饋調節(jié)系統(tǒng)參與了HSP的形成和進展。

國外學者也曾報道，炎癥損傷過程中中性粒細胞的激活及其產(chǎn)生的氧化代謝產(chǎn)物是活化補體的一種重要方式，并且兩者之間存在相互促進的反饋作用，即炎性損傷過程中，補體活化誘發(fā)中性粒細胞呼吸爆發(fā)，而中性粒細胞產(chǎn)生的自由基又可促進補體的活化〔10，11〕。該反饋作用極可能是調節(jié)炎癥反應及損傷的一個重要方式。此外，在器官和血管等炎癥發(fā)生時，腫瘤壞死因子、IL、TGF-β等炎性因子表達增加，而中性粒細胞也可大量產(chǎn)生上述因子，誘發(fā)組織損傷，并且這些因子還能反過來激活機體產(chǎn)生更多的中性粒細胞，形成惡性循環(huán)〔12〕。在補體活化的前提下，炎性因子還可刺激骨髓產(chǎn)生并釋放中性粒細胞，增加表面黏附分子的表達，加速中性粒細胞向組織侵入，誘導其發(fā)生呼吸爆發(fā)和脫顆粒，促使血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生纖溶酶原激活物抑制因子，導致血管炎癥發(fā)生〔13，14〕。本研究通過構建HSP動物模型發(fā)現(xiàn)補體-中性粒細胞反饋的炎癥應答調控在HSP的形成中具有重要作用，而且還采用了NAC和H2O2雙向調控ROS水平，從正反兩方面證實了干預ROS能夠抑制HSP的發(fā)生和進展。

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〔2014-02-17修回〕

(編輯徐杰)