何首烏飲對衰老大鼠下頜下腺p16/Rb細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的影響

葛志華崔宙開1楊寧李俊玫王春艷2柴淑慧3楊佳寧

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院科研處，河北承德067000)

摘要〔〕目的觀察何首烏飲對衰老大鼠下頜下腺p16/Rb細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的影響。方法選用8周齡SD雌性大鼠50只，隨機(jī)分為何首烏飲干預(yù)預(yù)防和治療性實(shí)驗(yàn)兩大部分，分為五組，每組5只，用D-半乳糖制造衰老大鼠模型，Western印跡法檢測p16、非磷酸化Rb蛋白含量。結(jié)果預(yù)防各組間p16和非磷酸化Rb蛋白表達(dá)均以模型組最高，正常組最低，各預(yù)防組處于中間水平，其中以預(yù)防中劑量組(Pm)最低(P<0.01)。治療各組間p16和非磷酸化Rb蛋白表達(dá)均以自然恢復(fù)組(S-R)最高，陰性對照組最低，各治療組中以治療中劑量組(Tm)最低(P<0.01)。結(jié)論何首烏飲延緩下頜下腺細(xì)胞衰老的作用可能與激活Rb/p16通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕何首烏飲；衰老大鼠；下頜下腺；p16；Rb

中圖分類號〔〕R289.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：河北省引進(jìn)留學(xué)人員資助項(xiàng)目(2012001056)

通訊作者：王春艷(1960-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事組織胚胎學(xué)研究。

1平泉縣醫(yī)院2承德醫(yī)學(xué)院組胚教研室3承德市中醫(yī)院

第一作者：葛志華(1956-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事口腔組織病理學(xué)研究。

p16基因是一種重要的抑癌基因，是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過抑制CDK的活性使Rb正常地行使G1期阻滯功能，使細(xì)胞周期停止，阻斷細(xì)胞增殖〔1～3〕。近年研究發(fā)現(xiàn)它與細(xì)胞衰老過程關(guān)系密切。Krishnamurthy等〔4〕提出p16的表達(dá)能夠作為生理上的衰老的一個標(biāo)志物。本文觀察何首烏飲對衰老大鼠下頜下腺p16、非磷酸化Rb蛋白表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1儀器與試劑Gel3000電泳圖像定量分析系統(tǒng)(中國北京)； DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(德國Leica公司)。p16和非磷酸化Rb單克隆抗體(北京中杉金橋生物有限公司)；BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒、細(xì)胞裂解試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；ECL檢測試劑盒(上海吉泰新繹生物科技有限公司)。

1.2藥物配方及用法何首烏飲由炙何首烏、懷牛膝、肉蓯蓉、淫羊藿、丹參、茯苓組成(本院賈春華教授提供)；何首烏飲給藥方法：高、中、低劑量何首烏飲分別為3.872、1.936及0.968 g·100 g-1·d-1，分別水煎濃縮成0.6 ml·100 g-1·d-1，灌胃，1次/d。

1.3實(shí)驗(yàn)動物的選擇及分組選用8周齡清潔級SD雌性大鼠50只，體重180～220 g，實(shí)驗(yàn)大鼠購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心 合格證編號：605106，隨機(jī)分為預(yù)防性和治療性兩大實(shí)驗(yàn)部分，每部分5組，每組5只。

1.4模型的建立及各組動物的處理方法模型組大鼠腹腔注射6%D-半乳糖300 mg·kg-1·d-1(0.5 ml·100 mg-1·d-1)，連續(xù) 60 d。預(yù)防性實(shí)驗(yàn)部分：正常組(NC組)正常喂養(yǎng)60 d；模型組腹腔注射D-半乳糖，1次/d，連續(xù)60 d；其余3組大鼠，作為何首烏飲預(yù)防高(Ph)、中(Pm)、低(Pl)劑量組，從造模的第一天起，在腹腔注射D-半乳糖的同時分別用高、中、低劑量何首烏飲灌胃，每天一次。60 d后各組大鼠末次給藥后1 h，10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉，剪開頸部皮膚暴露下頜下腺，分離并摘取下頜下腺。置液氮中保存?zhèn)溆?。治療性?shí)驗(yàn)部分：陰性對照組(NC組)稱重后按0.5 ml·100 mg-1·d-1腹腔注射生理鹽水，1次/d，連續(xù)60 d后改為生理鹽水灌胃(0.6 ml·100 g-1·d-1)60 d；另外4組用D-半乳糖腹腔注射，每天一次，連續(xù)60 d造成衰老動物模型，取其中三組作為何首烏飲治療高(Th)、中(Tm)、低(Tl)劑量組每天分別用高、中、低劑量何首烏飲灌胃，連續(xù)60 d；另一組衰老模型作為自然恢復(fù)組(S-R)正常喂養(yǎng)60 d。120 d后治療性實(shí)驗(yàn)部分的5個組共同取材(同預(yù)防性實(shí)驗(yàn)部分)。

1.5蛋白印跡法檢測p16、非磷酸化Rb蛋白含量采用上海生工提供的細(xì)胞裂解試劑盒提取總蛋白，并用BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定各實(shí)驗(yàn)組總蛋白含量，分裝后儲存于-80 ℃待用；電泳分離蛋白質(zhì)至溴酚藍(lán)移動至膠底部終止。用水浴式電轉(zhuǎn)移裝置將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；封閉PVDF膜分別加入Rb、p16單克隆抗體(抗體稀釋度：1∶200)，室溫2 h；用PBS漂洗膜3次，放入雜交盒，加入HRP標(biāo)記相應(yīng)二抗(抗體稀釋度：1∶2 000)，37 ℃孵育1 h；將PVDF膜平鋪在保鮮膜上，用ECL顯色1 min，暗盒中曝光20 min，顯影，定影。將條帶掃描至計算機(jī)中，用軟件Bandscan5.0進(jìn)行半定量分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件行單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

方差分析結(jié)果顯示，預(yù)防性實(shí)驗(yàn)部分的組間p16和非磷酸化Rb蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。多重比較結(jié)果顯示，以模型組最高，NC組最低，各預(yù)防組處于中間水平，其中Pm組最低(P<0.01)；治療性實(shí)驗(yàn)部分的組間p16和非磷酸化Rb蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。多重比較結(jié)果顯示，以S-R組最高，NC組最低，各治療組處于中間水平，其中Tm組最低(P<0.01)。見圖1、表1。

圖1　Western印跡法檢測各組p16和非磷酸化 Rb蛋白的表達(dá)

組別預(yù)防性實(shí)驗(yàn)p16 Rb組別治療性實(shí)驗(yàn)p16 RbNC組0.48±0.021)0.81±0.031)NC組0.53±0.052)0.77±0.052)模型組1.94±0.021.69±0.03Th組1.39±0.052)4)1.41±0.022)4)Ph組0.80±0.071)3)1.10±0.031)3)Tm組1.11±0.052)1.30±0.042)Pm組0.59±0.031)0.98±0.021)Tl組1.36±0.032)4)1.48±0.032)4)Pl組0.99±0.051)3)1.22±0.021)3)S-R組1.96±0.021.71±0.02

與模型組比較：1)P<0.01；與SR組比較：2)P<0.01；與Pm組比較：3)P<0.01；與 Tm組比較：4)P<0.01

3討論

衰老是生物隨著時間的推移，自發(fā)的必然過程。機(jī)體的衰老源于細(xì)胞的衰老。細(xì)胞衰老時細(xì)胞器形態(tài)、數(shù)量、功能均發(fā)生改變、細(xì)胞增殖能力減退、甚至凋亡。衰老細(xì)胞的細(xì)胞周期常阻滯于細(xì)胞周期中最關(guān)鍵的調(diào)控點(diǎn)G1/S期或G2/M期，尤其是G1末期的限制性調(diào)控點(diǎn)“R”點(diǎn)的阻滯。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因產(chǎn)物Rb蛋白對其起著“閘門”的作用。Rb蛋白在衰老細(xì)胞中處于非磷酸化狀態(tài)而具有活性，可導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯以及細(xì)胞周期不可逆地阻滯于G1期。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)催化Rb蛋白使其磷酸化后失活。p16是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，可特異抑制細(xì)胞周期蛋白D(CyclinD)-CDK4活性，從而使其底物Rb蛋白保持非磷酸化形式〔5〕。因此，細(xì)胞在衰老過程中有p16蛋白的積聚〔6〕。

近年發(fā)現(xiàn)，p16是引起細(xì)胞衰老的始動因素之一〔7〕，同時p16編碼基因在超過30%的人類腫瘤中失活〔8〕，是重要的抑癌基因同時也是一種細(xì)胞周期抑制蛋白。Bringold等〔9〕將與衰老有關(guān)的CDKI途徑歸納為p16INK4a/Rb、p19ARF/p53/p21cip1及PTEN/p27kip1。其中，p16INK4a/Rb和p19ARF/p53既是細(xì)胞衰老途徑，同時也是腫瘤抑制途徑〔1〕。p16選擇性地抑制cyclinD-CDK4-CDK6，進(jìn)而抑制Rb磷酸化。因此，主要調(diào)控Rb通路：p16/cyclinD/CDK4-CDK6/Rb/E2F。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，何首烏飲可通過降低p16、非磷酸化Rb蛋白活性等環(huán)節(jié)阻斷通過p16/cyclinD/CDK4- CDK6/Rb/E2F途徑對Rb蛋白的磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖，延緩衰老，其中以預(yù)防中劑量組效果最好。

4參考文獻(xiàn)

1鄭文婕，童坦君，張宗玉.細(xì)胞衰老的重要通路P16ink4a/Rb和P19ARF/P53/P21cip1信號途徑〔J〕.生命化學(xué)，2002；22(4)：314-6.

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3Geradts J,Kratzke RA,Niehans GA,etal.Immunohistochemical detection of the cyclin-dependent kinase inhibitor 2 /multiple tumor suppressor gene 1(CDKN2 /MTS1 )product p16ink4a in archival human solidtumors:correlation with retinoblastoma protein expression〔J〕.Cancer Res,1995;55(24):6006-11.

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7Duan JM，Zhang Z,Tong T.Senescence delay of human diploid fibroblast induced by anti-sense p16INK4a expression〔J〕.J Biol Chem,2001;276(51):48325-31.

8Rusa M,Petters G.The p16INK4a/CDKN2A tumor suppressor and its relatives〔J〕.Biochim Biophys Acta,1998;1378(2):115-7.

9Bringold F,Serrano M.Tumor suppressors and oncogenes in cellular senescence〔J〕.Exp Gerontol,2000;35(3):317-29.

〔2013-02-25修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)