三葉青水提物對慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥的抑制作用

王小莉 呂江明

(吉首大學醫(yī)學院，湖南吉首416000)

摘要〔〕目的探討三葉青水提物對慢性阻塞性肺疾病(COPD)實驗性大鼠炎癥的影響。方法選擇煙熏加氣管內(nèi)注射脂多糖(LPS)法復制COPD模型，將健康SD雄性大鼠60只，隨機分為5組：正常對照組，COPD模型組和三葉青低劑量、中劑量、高劑量組(分別為0.5、1.0、2.0 g/kg)，每組12只。造模成功后肺組織HE染色觀察氣道病理改變，測定血清和肺組織中C-反應蛋白(CRP)、白細胞介素(IL)-6的水平，取支氣管肺泡灌洗液(BALF)測定炎癥細胞數(shù)和白細胞比率。結(jié)果三葉青各劑量組CRP、IL-6水平及炎癥細胞總數(shù)及白細胞比例較模型組明顯減少(P<0.05)，高、中、低劑量組炎癥細胞總數(shù)和中性粒細胞比例顯著下降，并呈一定的劑量效應關(guān)系(P<0.05)。與正常對照組比較，模型組和各治療組中CRP、IL-6水平及炎癥細胞總數(shù)和中性粒細胞比例顯著升高(P<0.05)。結(jié)論三葉青水提物能夠抑制COPD大鼠的炎癥反應。

關(guān)鍵詞〔〕三葉青水提物；白細胞介素(IL)-6；C-反應蛋白；慢性阻塞性肺疾病

中圖分類號〔〕R361〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：湖南省科技計劃項目(No.2014SK3010)

三葉青屬于葡萄科屬植物，具有清熱解毒、祛風化痰、活血止痛的功效，臨床用來治療小兒驚厥高熱、肺炎、支氣管炎、咽喉炎、痢疾、肝炎、病毒性腦膜炎、腫瘤等癥〔1〕。三葉青對于炎癥的研究較少。本研究用三葉青水提物對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型進行干預，通過觀察大鼠肺組織病理改變，檢測血清及肺組織中C-反應蛋白(CRP)、白細胞介素6(IL-6)的水平，檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細胞及分類，探討三葉青對炎癥的影響及其機制。

1材料和方法

1.1實驗動物健康SD雄性大鼠購買于湖南長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務部，動物編號HNACSDC20120292，體重(272±28)g，鼠齡12 w。

1.2分組將60只大鼠隨機分為5組：正常對照組、模型組和三葉青低、中、高劑量組，每組12只。

1.3三葉青水提物的提取三葉青由呂江明老師在湖南吉首市郊采集，由我院中藥學李春艷教授鑒定。將三葉青全株500 g干燥、粉碎，過篩，水煎3次，每次30 min，合并水煎液，濃縮為1 g/ml(生藥)，得到三葉青水提物。

1.4COPD模型制作采用2次氣管內(nèi)注入LPS(LPS)和反復煙熏的方法制作COPD大鼠模型〔2〕。第1、14天各向氣管內(nèi)緩慢注入脂多糖200 μg (200 μl)，將大鼠放入的有機玻璃制成的煙熏箱內(nèi)，在其右上角開通1個直徑1 cm的通氣孔，將點燃的香煙(長沙卷煙廠白沙牌香煙)通過三通將煙霧吸入100 ml的注射器中，關(guān)閉吸煙通路一端，再打開三通的另一端將煙霧注入煙熏箱內(nèi)進行大鼠被動吸煙，每天吸煙2次，每次16支，時間30 min，2次間隔4 h，連續(xù)28 d。吸煙8 d后每天吸煙前通過灌胃器給大鼠灌三葉青水提物(低劑量組、中劑量組、高劑量組為0.5、1.0、2.0 g/kg，加生理鹽水至2 ml)，共28 d。正常對照組灌入等容量的生理鹽水，28 d后處死大鼠用于實驗觀察。

1.5肺組織病理學標本制作各組于實驗結(jié)束后次日取每只大鼠右中葉肺組織，用4%甲醛固定24 h后石蠟包埋制成切片，HE染色光學顯微鏡下觀察。

1.6勻漿肺組織取500 mg肺組織，加入生理鹽水1.0 ml，組織勻漿器充分研磨，5 000 r/min離心10 min，取上清0.1 ml，加生理鹽水至1.0 ml，充分混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清液待測。

1.7血清采集從大鼠心臟取血約5 ml,3 500 r/min，離心半徑20 cm,10 min，取血清-20℃保存。

機械電氣一體技術(shù)在應用的過程中，由于其具有數(shù)字顯示、程序控制功能，無需設計過多的手柄、按鈕，其操作相對比較方便。同時，鑒于該技術(shù)具有重復動作的功能，可以自動選擇程序，減少了操作人員的工作量。

1.8BALF的采集將大鼠右主支氣管結(jié)扎，用套管針穿刺至左肺，緩慢注入無菌生理鹽水3 ml，重復3次，每次注入后立即回吸，灌洗液紗布過濾，回收率大于80%，得到BALF合格標本。用于白細胞總數(shù)計數(shù)和細胞分類計數(shù)。

1.9CRP、IL-6水平的測定利用H6000-020全自動生化分析儀，嚴格按照說明書進行檢測，大鼠CRP試劑盒、IL-6試劑盒購買于湖北武漢博士德生物有限公司。

1.10統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1各組大鼠病理改變正常對照組大鼠支氣管黏膜纖毛柱狀上皮排列整齊，氣道、管壁及周圍炎癥細胞浸潤；模型組的大鼠支氣管黏膜上皮變性、脫落，管壁伴有淋巴細胞浸潤，肺泡囊和肺泡擴張明顯，肺泡壁變薄伴有不同程度的斷裂，形成肺大皰。三葉青低劑量、中劑量及高劑量組大鼠黏膜上皮改變、炎性細胞浸潤以及肺泡腔擴大、肺泡壁斷裂情況較模型組有不同程度的減輕，較正常對照組重。見圖1。

模型組

對照組

三葉青低劑量組

三葉青中劑量組

三葉青高劑量組

圖1各組大鼠病理改變(HE，×100)

2.2實驗大鼠血清及肺組織勻漿中CRP、IL-6的測定與正常對照組比較，模型組血清及肺組織中的CRP、IL-6明顯增多(P<0.01)。與模型組比較，三葉青高、中、低劑量組血清及肺組織中的CRP、IL-6均減少(P<0.05)。三葉青低、中劑量組間血清及肺組織中的CRP、IL-6水平無明顯差異(P>0.05)，三葉青高劑量組與低劑量組差異顯著(P<0.05)。見表1。

2.3支氣管肺泡灌洗液中細胞計數(shù)及分類與正常對照組比較，模型組中BALF炎癥細胞總數(shù)和白細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。高、中、低各劑量治療組炎癥細胞總數(shù)和白細胞比例較模型組減少，并呈一定的劑量效應關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，治療組中性粒細胞計數(shù)高于正常對照組(P<0.05)。見表1。

組別 CRP(μg/ml) IL-6(pg/ml) 血清肺組織血清肺組織白細胞總數(shù)(×108/L)中性粒細胞(%)單核細胞(%)淋巴細胞(%)正常對照組0.4327±0.0230.6378±0.02317.98±2.1240.23±0.131.78±0.813.48±0.5384.38±8.1312.91±6.89COPD模型組1.238±0.0171)1.6380±0.0251)60.23±3.181)101.22±0.231)5.88±0.491)21.98±4.991)70.03±6.127.86±3.28低劑量治療組0.9253±0.0122)0.9025±0.0322)40.82±2.092)70.94±0.152)4.28±0.452)15.28±3.152)77.27±5.137.23±2.28中劑量治療組0.8438±0.0342)0.8256±0.0202)34.28±3.322)55.83±0.222)3.23±0.231)2)14.38±2.781)2)79.29±4.896.53±1.98高劑量治療組0.5500±0.0182)3)0.4416±0.0062)3)30.89±2.142)3)50.78±0.142)3)2.13±0.382)3)10.23±2.082)3)80.23±4.326.98±3.21

與正常對照組比較：1)P<0.01，與模型組比較：2)P<0.05，與三葉青低劑量組比較：3)P<0.05

3討論

吸煙可刺激單核巨噬細胞和中性粒細胞等炎癥細胞產(chǎn)生前炎癥因子、趨化因子及細胞因子，如TNF、細胞間黏附分子(ICAM-1)、IL-6、IL-8等，導致白細胞黏附、移行到炎癥部位參與炎癥反應〔3〕。LPS為革蘭陰性菌的外層結(jié)構(gòu)可直接造成氣道上皮損傷,又可激活巨噬細胞、淋巴細胞,生成前致炎因子腫瘤壞死因子(TNF)、IL-1、IL-6等,趨化并激活中性粒細胞,釋放蛋白酶等細胞毒性物質(zhì),導致支氣管慢性炎癥及肺氣腫形成〔2〕。本實驗通過熏煙加氣管內(nèi)注射LPS法建立COPD大鼠模型，光學顯微鏡下觀察到COPD模型組大鼠肺泡壁、支氣管壁、肺泡間隔可見大量炎癥細胞浸潤，黏膜下層、肌層、血管周圍大量炎癥細胞浸潤，肺泡壁變薄斷裂，肺泡結(jié)構(gòu)不完整，肺大皰形成，符合COPD病理改變。采用兩次氣管內(nèi)注入適量LPS和反復熏煙的方法,可成功地復制出大鼠COPD 模型。本研究結(jié)果說明三葉青可以減輕COPD肺組織炎癥病理改變，對COPD炎癥有一定的防治作用。

近年研究表明，COPD氣道炎癥是以淋巴細胞、肺泡巨噬細胞和中性粒細胞浸潤為主，這些被激活的炎癥細胞可釋放許多炎性介質(zhì)及細胞因子，參與氣道炎癥的進展，而IL-6、IL-8是參與COPD氣道炎癥的重要細胞因子〔4,5〕。本實驗結(jié)果說明COPD氣道及肺組織中的炎癥細胞以中性粒細胞和巨噬細胞為主，與曹麗華等〔6〕研究結(jié)果相符。本研究結(jié)果提示IL-6參與了COPD的炎癥反應，是介導COPD炎癥重要的細胞因子，三葉青提取物可以降低IL-6的含量，對炎癥有一定的抑制作用。

CRP是一種對多種刺激因素包括感染、組織損傷、壞死都能迅速發(fā)生反應的蛋白，?？勺鳛橐环N反應炎癥、組織損傷程度以及評價治療反應的非特異性敏感指標〔7〕。本實驗說明CRP在COPD具有較高的表達，CRP參與了COPD的炎癥反應，是反映病情的重要生物學標志。三葉青通過減低CRP的表達對大鼠COPD的炎癥有一定的抑制作用，并且呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。

4參考文獻

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6曹麗華，康健，王洋，等. 標準桃金娘油對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥的影響〔J〕.大連醫(yī)科大學學報，2010;32(1)：18-22.

7Germani A，Limana F，Capogrossi MC. Pivotal advances :high-mobility group box 1 protein-a cytokine with a role in cardiac repair〔J〕. J Leukoc Biol，2007;81(1):41-5.

〔2013-12-07修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)