九龍蟲對(duì)衰老小鼠免疫功能的影響

周先云潘朝旺

(鄂州職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖北鄂州436000)

摘要〔〕目的觀察九龍蟲對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠免疫功能的影響。方法60只昆明小鼠隨機(jī)分成6組，正常組、模型組、陽性對(duì)照組、高劑量、中劑量、低劑量九龍蟲組。D-半乳糖連續(xù)腹腔注射制作亞急性衰老的大鼠模型。42 d后，檢測(cè)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，血清白介素(IL)-2、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量，脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率、脾臟自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)活性和腹腔吞噬細(xì)胞吞噬能力。結(jié)果與正常組比較，模型組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、血清IL-2、脾臟NK細(xì)胞殺傷力和腹腔吞噬細(xì)胞吞噬能力明顯下降，血清IL-6、TNF-α、脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率明顯升高，各給藥組的上述指標(biāo)均得到改善。結(jié)論九龍蟲抗衰老作用可能通過改善機(jī)體免疫功能而實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞〔〕九龍蟲；衰老；免疫功能

中圖分類號(hào)〔〕R285〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(B2013002)；鄂州職業(yè)大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目(2013zd04)

第一作者：周先云(1967-)，女，副教授，主要從事藥學(xué)研究。

九龍蟲，別名“洋蟲”，在《本草綱目拾遺》和《中藥大辭典》均有記載，對(duì)多種疾病有良效〔1〕。在民間，九龍蟲被廣泛用著抗衰老保健食品，但對(duì)于九龍蟲的抗衰老研究，尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究九龍蟲對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠免疫功能的影響，探討其延緩衰老機(jī)制。

1材料與儀器

1.1動(dòng)物昆明種小鼠60只，體重(20±2)g，雌雄各半，清潔級(jí)，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字-042，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2藥品與試劑D-半乳糖(20120213)，上海喜潤(rùn)化學(xué)工業(yè)有限公司；九龍蟲散，本院自制，用前配成混懸液；靈芝多糖(20120422)，浙江益圣菌物發(fā)展有限公司；白介素(IL)-2 測(cè)定試劑盒(20120625)，IL-6測(cè)定試劑盒(20120614)，腫瘤壞死因子(TNF)-α測(cè)定試劑盒(20120526)，購(gòu)于上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(20120509)，天津百浩生物科技有限公司。

1.3儀器9602A酶標(biāo)儀，南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器公司；COULTEREPICSXL流式細(xì)胞儀，美國(guó)；PT-MR3100D組織勻漿機(jī),瑞士Polytron公司。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物造模及分組給藥取小鼠60只，隨機(jī)分為6組：分別為正常組、模型組、陽性對(duì)照組、高劑量、中劑量、低劑量九龍蟲組。除正常組外，其余各組每日頸背皮下注射半乳糖120 mg/kg，連續(xù)42 d，致亞急性衰老模型，正常組注射等量生理鹽水。造模同時(shí)分別灌胃給予高、中、低劑量九龍蟲混懸液0.028、0.014、0.007 g·kg-1·d-1，陽性對(duì)照組給予靈芝多糖0.1 g·kg-1·d-1，正常組及模型組給予生理鹽水15 ml·kg-1·d-1。末次給藥24 h后，稱重，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.2血清IL-2、IL-6、TNF-α的測(cè)定將小鼠摘除眼球取血，離心，制備血清，按試劑盒說明測(cè)定血清中IL-2 、IL-6、TNF-α含量。

1.4.3胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的測(cè)定小鼠取血后斷頸處死，立即取胸腺和脾臟稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重量(g)/體重(g)。

1.4.4脾臟淋巴細(xì)胞凋亡檢測(cè)脾臟稱重后立即剝離干凈，生理鹽水沖洗，取一半(另一半用于NK細(xì)胞活性測(cè)定)研磨過100目篩(加磷酸鹽緩沖液)，離心1 000 r/min 10 min，棄上清液，加紅細(xì)胞裂解液適量，混勻，靜置5～6 min，待紅細(xì)胞完全破碎，離心1 000 r/min 10min，棄上清液去除紅細(xì)胞，用加入10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度2×106個(gè)/ml，取上述液體0.1 ml按ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.4.5脾臟NK細(xì)胞活性的檢測(cè)取另一半脾臟，按照文獻(xiàn)〔2〕的方法測(cè)定NK細(xì)胞活性，以殺傷力(%)表示。

1.4.6腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的檢測(cè)小鼠取脾臟后，按照文獻(xiàn)〔3〕的方法提取腹腔巨噬細(xì)胞，中性紅實(shí)驗(yàn)檢測(cè)吞噬能力。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1對(duì)小鼠血清IL-2、IL-6、TNF-α的影響與正常組比較，模型組小鼠血清IL-2含量降低，IL-6和TNF-α含量升高(P<0.01)；陽性對(duì)照組和九龍蟲各劑量組與模型組相比，血清IL-2升高，IL-6和TNF-α含量降低(P<0.05或P<0.01)。見表1。

組別IL-2(ng/ml)IL-6(pg/ml)TNF-α(pg/ml)正常組8.54±1.562)129.32±11.652)5.06±0.422)模型組5.98±1.13162.46±15.286.83±0.51陽性對(duì)照組7.88±1.212)137.34±15.372)5.66±0.432)高劑量九龍蟲組8.04±1.372)138.48±13.242)5.43±0.482)中劑量九龍蟲組7.26±1.352)143.87±11.072)5.61±0.522)低劑量九龍蟲組7.32±1.392)145.46±11.832)6.32±0.551)

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.2對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響與正常組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)降低(P<0.01)；陽性對(duì)照組和九龍蟲各劑量組與模型組相比，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)升高(P<0.05或P<0.01)。見表2。

組別胸腺(g/g)脾臟(g/g)正常組0.426±0.0942)0.572±0.0822)模型組0.325±0.0750.443±0.065陽性對(duì)照組0.393±0.0812)0.551±0.0752)高劑量九龍蟲組0.412±0.0802)0.564±0.0712)中劑量九龍蟲組0.382±0.0792)0.502±0.0732)低劑量九龍蟲組0.379±0.0762)0.480±0.0791)

2.3對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡的影響與正常組比較，模型組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)；陽性對(duì)照組和九龍蟲各劑量組與模型組相比，淋巴細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。見表3。

2.4對(duì)小鼠脾臟NK細(xì)胞活性的影響與正常組比較，模型組小鼠脾臟NK細(xì)胞殺傷力降低(P<0.01)；與模型組相比，陽性對(duì)照組和高劑量九龍蟲組NK細(xì)胞殺傷力顯著升高(P<0.01)，高劑量九龍蟲組明顯升高(P<0.05)，低劑量九龍蟲組也有所升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.5對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響與正常組比較，模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力降低(P<0.01)；陽性對(duì)照組和九龍蟲各劑量組與模型組相比，巨噬細(xì)胞吞噬能力顯著升高(P<0.01)。見表3。

組別脾淋巴細(xì)胞凋亡率(%)脾NK細(xì)胞殺傷力(%)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力(A值)正常組18.35±3.592)56.39±6.832)0.66±0.0542)模型組26.44±3.8741.20±5.310.43±0.038陽性對(duì)照組21.62±2.982)51.87±5.952)0.58±0.0672)高劑量九龍蟲組20.97±3.212)52.69±6.422)0.60±0.0482)中劑量九龍蟲組22.58±2.842)46.64±5.271)0.55±0.0522)低劑量九龍蟲組21.63±3.052)43.29±6.080.51±0.0452)

3討論

胸腺是機(jī)體的中樞免疫器官，有報(bào)道〔4〕認(rèn)為，胸腺衰老在免疫衰老過程中起主導(dǎo)作用，胸腺的衰老受胸腺內(nèi)環(huán)境、細(xì)胞凋亡及神經(jīng)內(nèi)分泌等的調(diào)控，在這些因素的影響下，胸腺功能發(fā)生變化，胸腺衰老可影響機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫導(dǎo)致繼發(fā)性免疫缺陷。脾臟是人體最大的外周免疫器官,它的功能與機(jī)體特異性免疫和非特異性免疫密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)顯示衰老時(shí)胸腺和脾臟都出現(xiàn)萎縮。

IL-2、IL-6在衰老機(jī)體免疫功能或紊亂的發(fā)生過程中起著重要作用。IL-2具有促進(jìn)T細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)NK細(xì)胞、T細(xì)胞活性，誘導(dǎo)干擾素生成的作用，是重要的免疫增強(qiáng)因子，其水平降低是免疫衰老的重要分子機(jī)制，IL-2與衰老的關(guān)系，已經(jīng)受到關(guān)注〔5〕。IL-6作為一種主要的免疫調(diào)節(jié)物,其水平異常升高可使機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)；導(dǎo)致免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂；促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化等作用，是機(jī)體免疫衰老的一個(gè)重要原因〔6〕。TNF-α作為一種多功能細(xì)胞因子，在炎性衰老中起著重要作用，其濃度隨著大鼠月齡的增加而升高〔7〕，因此可以作為分析衰老程度的指標(biāo)之一。隨著大鼠月齡的增加，淋巴細(xì)胞的凋亡率逐漸升高〔8〕，健康老年人比健康成年人外周血淋巴細(xì)胞的凋亡率明顯增高〔9〕。NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞反映了機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)，機(jī)體衰老時(shí)它們的殺傷力和吞噬能力下降〔10〕。

本實(shí)驗(yàn)顯示，九龍蟲對(duì)衰老模型小鼠免疫功能有明顯影響，可抑制衰老小鼠胸腺和脾臟的萎縮；升高血清IL-2含量，降低IL-6、TNF-α含量；抑制淋巴細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞功能，通過這些因素而發(fā)揮延緩衰老的作用。

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〔2013-05-27修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)