慢性腎衰竭大鼠血清和尿液血管緊張素原與腎功能指標(biāo)及病理改變的相關(guān)性

胡天曉牛凱劉冰

(河北省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，河北石家莊050051)

摘要〔〕目的研究慢性腎衰竭大鼠血清及尿液血管緊張素原(AGT)與腎功能指標(biāo)及腎臟病理損傷程度之間的關(guān)系。 方法采用5/6腎切除法建立慢性腎衰竭的大鼠模型，測定慢性腎衰進(jìn)展過程中不同階段的血清肌酐、尿素氮、尿液肌酐、尿蛋白定量情況，并計(jì)算肌酐清除率，對腎臟行病理觀察并利用腎小球硬化指數(shù)(GSI)、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)(TIS)兩項(xiàng)指標(biāo)評價(jià)損傷程度，同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法測定血清、尿液的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和AGT水平，分析AGT與各指標(biāo)之間的相關(guān)性。結(jié)果血AGT與各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著相關(guān)性。尿AGT與Ccr呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.667，P<0.01)，與尿AngⅡ呈顯著正相關(guān)(r=0.497，P<0.01)，與GSI呈正相關(guān)(r=0.545，P<0.05)，與其他指標(biāo)無顯著相關(guān)性。結(jié)論尿AGT在一定程度上能夠反映腎功能的情況，并可作為評價(jià)腎小球硬化程度的一項(xiàng)無創(chuàng)性指標(biāo)。

關(guān)鍵詞〔〕慢性腎衰竭；血管緊張素原；血管緊張素Ⅱ；病理損傷評價(jià)

中圖分類號〔〕R692.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(12276104D85)

通訊作者：劉冰(1964-)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事慢性腎臟病的基礎(chǔ)及臨床研究。

第一作者：胡天曉(1987-)，女，在讀碩士，主要從事慢性腎臟病的基礎(chǔ)及臨床研究。

血管緊張素原(AGT)作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要組分之一，是腎素的唯一底物，其水平可能能夠反映RAS系統(tǒng)激活的狀態(tài)，AGT主要在肝臟合成，肝外組織也有AGT mRNA表達(dá)，由于其分子量約為50～60 kD，循環(huán)中的AGT不能通過腎小球的濾過膜，腎臟局部的AGT主要是由近端腎小管分泌產(chǎn)生的〔1〕，進(jìn)一步形成血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)，未轉(zhuǎn)化的AGT隨尿液排出體外，腎內(nèi)血管緊張素原水平與循環(huán)中的水平關(guān)系不大。尿液AGT與腎臟疾病狀態(tài)的關(guān)系如何尚未見報(bào)道。本研究通過建立慢性腎衰竭的大鼠模型研究了血清及尿液AGT與腎功能指標(biāo)及病理改變的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1動(dòng)物模型建立選取5～6周齡、體重150～170 g清潔級雄性SD大鼠84只，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠自由飲水,常規(guī)飼養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分組：假手術(shù)組(n=42)和模型組(n=42)。模型組采用經(jīng)典的Platt法〔2〕進(jìn)行5/6腎切除術(shù)制作慢性腎衰竭模型，手術(shù)分Ⅰ、Ⅱ兩期進(jìn)行。假手術(shù)組同期進(jìn)行手術(shù)，均采取同樣步驟，但兩次手術(shù)均僅分離腎周脂肪囊及腎蒂，剝離左、右腎筋膜，不做腎切除。

1.2動(dòng)物分組及取材以Ⅱ期手術(shù)結(jié)束作為觀察周期的起點(diǎn)，分別于第4、6、8、10、12、14周末的前1 d隨機(jī)抽取假手術(shù)組、模型組大鼠各6只，禁食，自由飲水，分別置于代謝籠中，收集24 h尿液，記錄總尿量，留存尿液約5 ml，3 000 r/min離心10 min，取上清置于-70℃保存，余尿液立即送檢24 h尿蛋白定量(UP)。于上述各周末以3%水合氯醛腹腔注射麻醉動(dòng)物后，腹主動(dòng)脈穿刺取血，收集全血標(biāo)本約6 ml，3 000 r/min離心10 min，取上層血清置于-70℃保存。假手術(shù)組摘取左側(cè)腎臟、模型組摘取左側(cè)殘腎，沿標(biāo)本長軸適當(dāng)切分后，立即投入4%甲醛緩沖液中固定，待行病理切片染色。

1.3觀察指標(biāo)觀察大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)度、毛發(fā)光澤度、攝食及死亡情況。每兩周稱量1次體重，觀察體重變化情況。

1.3.1生化測定采用日本HITACHI 7600-110型全自動(dòng)生化分析儀測定血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及尿液肌酐(Ucr)。酸沉淀比濁法測定24 h尿蛋白定量。參照文獻(xiàn)〔3〕計(jì)算肌酐清除率(Ccr)。

1.3.2腎臟病理檢查對已固定的腎臟組織進(jìn)行石蠟包埋，行HE、PAS及Masson染色。采用Raij等〔4〕的半定量評分系統(tǒng)評價(jià)腎小球的損傷程度，每張PAS染色切片于高倍鏡下觀察40個(gè)腎小球，按腎小球受損情況分為0～4級病變。0級：腎小球無硬化；1級：腎小球硬化面積≤25%；2級：25%<腎小球硬化面積≤50%；3級：50%<腎小球硬化面積≤75%；4級：75%<腎小球硬化面積≤100%。計(jì)算腎小球硬化指數(shù)(GSI)：(1×N1+2×N2+3×N3+4×N4)/N×100(N1為評分1級的腎小球個(gè)數(shù)，N2為評分2級的腎小球個(gè)數(shù)，N3為評分3級的腎小球個(gè)數(shù)，N4為評分3級的腎小球個(gè)數(shù)，N為計(jì)數(shù)腎小球的總數(shù)，即40)。采用Taal等〔5〕的半定量評分系統(tǒng)評價(jià)腎小管間質(zhì)的病變情況。每張Masson染色切片于200倍光鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)不含腎小球的視野。腎小管間質(zhì)病變由3個(gè)參數(shù)判定(蛋白管型和小管擴(kuò)張、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤、間質(zhì)纖維化程度)，每個(gè)參數(shù)分別按0～3分評定：無病變0分，輕度受損(受累面積<25%)1分，中度受損(受累面積25%～50%)2分，重度受損(受累面積>50%)3分。每個(gè)視野的觀察結(jié)果為3個(gè)參數(shù)評分的總和，10個(gè)視野的平均值為腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)(TIS)。

1.3.3血清、尿液的AngⅡ和AGT檢測采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(Bio-Swamp，中國上海)測定。

2結(jié)果

2.1一般情況假手術(shù)組大鼠表現(xiàn)機(jī)警、反應(yīng)敏捷，行為正常，皮毛致密整齊有光澤，飲食正常，尿道口無血性分泌物，體重逐漸增加。模型組大鼠精神萎靡、活動(dòng)遲緩，甚至弓背蜷體，皮毛疏松枯槁無光澤，食量減少，部分動(dòng)物尿道口可見血性分泌物，大便色質(zhì)正常，部分大鼠出現(xiàn)大便量減少，體重增加緩慢。隨著觀察周期延長，與假手術(shù)組相比，大鼠耳、鼻、足背、尾部皮膚略顯蒼白。處死大鼠時(shí)剖腹探查可見個(gè)別存在小至中等量腹腔積液。在模型制作過程中，沒有大鼠死亡。術(shù)后的觀察周期中，假手術(shù)組有2只大鼠死亡，死亡率4.8%。模型組有5只大鼠死亡，死亡率11.9%。經(jīng)觀察及尸檢，死亡原因?yàn)楦骨桓腥?、同伴撕咬、腸管粘連致腸梗阻等。

2.2生化指標(biāo)及血清、尿液AngⅡ、AGT變化情況模型組UP水平呈逐漸上升趨勢，而假手術(shù)組變化不大。Scr、BUN水平自第4周開始較假手術(shù)組出現(xiàn)明顯升高，后一度出現(xiàn)回落，大約第10周開始出現(xiàn)逐漸上升趨勢。Ccr在第6周出現(xiàn)明顯下降，第8周時(shí)出現(xiàn)輕度上升，之后為逐漸下降趨勢。見表1。血清及尿液AngⅡ水平第4周后出現(xiàn)短暫的下降趨勢，分別自第8周、第10周出現(xiàn)進(jìn)行性上升。血清AGT水平?jīng)]有觀察到明顯的趨勢性變化，尿液AGT自第4周開始逐漸下降，自第8周出現(xiàn)上升趨勢。見表2。

指標(biāo)組別第4周第6周第8周第10周第12周第14周UP(g/24h)假手術(shù)組16.84±6.8233.71±7.0120.04±12.1819.73±7.3923.16±3.9823.46±5.66模型組12.39±3.2322.63±6.961)51.19±6.522)73.42±35.652)62.04±32.131)151.69±94.122)Scr(μmol/L)假手術(shù)組64.67±9.7957.62±13.2556.30±5.5862.33±7.2159.43±6.2161.02±7.15模型組79.50±5.322)86.52±4.602)92.68±9.972)87.80±13.772)94.70±12.802)112.50±15.712)BUN(mmol/L)假手術(shù)組5.31±1.055.17±0.845.46±0.435.35±0.365.24±0.425.72±0.34模型組9.75±1.102)11.41±2.202)8.72±1.622)10.35±2.192)13.02±2.862)15.33±5.512)Ccr(ml/min)假手術(shù)組1.14±0.291.16±0.291.45±0.181.43±0.271.36±0.101.42±0.19模型組0.85±0.260.68±0.102)0.74±0.132)0.75±0.112)0.69±0.242)0.54±0.122)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

指標(biāo)組別第4周第6周第8周第10周第12周第14周血AngⅡ(pg/ml)假手術(shù)組20.63±4.0134.83±8.5348.34±8.8318.05±7.4520.70±8.4919.32±3.79模型組11.32±6.022)9.23±6.682)4.98±3.272)8.13±4.002)29.81±2.802)33.83±8.592)尿AngⅡ/Ucr(ng/gCr)假手術(shù)組16.28±5.2943.96±18.0324.53±10.3411.80±3.5614.64±5.0910.74±3.82模型組54.39±31.502)25.46±8.262)36.48±4.742)27.23±9.672)64.97±5.002)98.94±14.402)血AGT(ng/ml)假手術(shù)組5.71±4.099.58±2.565.02±4.146.31±3.457.11±2.897.89±2.90模型組3.32±0.992)4.33±2.382)4.19±3.112)6.59±2.292)3.79±1.872)6.78±2.532)尿AGT/Ucr(μg/gCr)假手術(shù)組8.53±1.5018.49±7.1911.66±2.268.79±2.809.60±1.759.93±2.60模型組16.41±11.462)14.89±7.802)7.13±3.172)11.70±7.372)30.89±7.192)18.58±5.372)

2.3病理損傷觀察假手術(shù)組大體觀察：各腎外觀及切面正常，離體腎臟呈均勻暗紅色，大小正常，有腎臟質(zhì)感。光鏡觀察：腎小球結(jié)構(gòu)正常，毛細(xì)血管袢開放，基底膜呈線性，無增厚，鮑曼囊囊腔清晰無擴(kuò)張，球囊無粘連，未見明顯的細(xì)胞增殖以及系膜增生；腎小管結(jié)構(gòu)清晰，無萎縮，管腔無擴(kuò)張，未見蛋白管型，腎間質(zhì)偶見少量炎細(xì)胞浸潤。模型組大體：各期大鼠腎臟均呈淡粉色或灰白色，體積有所增大，有水泡樣光澤，隨觀察周期的延長質(zhì)地漸硬，無腎臟質(zhì)感，個(gè)別殘腎切面與脾臟或周圍腸管粘連，殘腎剖面偶可見局部血栓形成。光鏡觀察：早期(第6周)：腎小球體積輕度增大，毛細(xì)血管袢開放，偶可見基底膜輕度增厚，鮑曼囊囊腔清晰無擴(kuò)張，球囊無粘連，部分腎小球可見輕度系膜細(xì)胞增生；腎小管結(jié)構(gòu)清晰，部分可見腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性，局部管腔稍有擴(kuò)張，未見蛋白管型，腎間質(zhì)偶可見灶狀炎細(xì)胞浸潤。中期(第10周)：腎小球體積增大，毛細(xì)血管袢開放，可見基底膜彌漫增厚，鮑曼囊囊腔清晰，可見輕度擴(kuò)張，部分可見球囊粘連，腎小球可見中重度系膜細(xì)胞增生；腎小管結(jié)構(gòu)清楚，部分可見腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性及刷毛緣脫落，管腔廣泛明顯擴(kuò)張，可見大量蛋白管型，腎間質(zhì)可見大量炎細(xì)胞浸潤及廣泛纖維組織增生。后期(第14周)：腎小球體積縮小，可見局灶節(jié)段性腎小球硬化，部分小球出現(xiàn)球性硬化，硬化區(qū)系膜基質(zhì)增生，細(xì)胞數(shù)減少，基底膜廣泛增厚，失去正常線性形態(tài)，鮑曼囊囊腔縮小或消失，部分可見球囊局部或廣泛粘連；腎小管多灶狀萎縮，部分囊腔縮小至消失，腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性明顯，部分管腔代償性擴(kuò)張，可見蛋白管型。腎間質(zhì)可見大量炎細(xì)胞浸潤及廣泛重度纖維組織增生。部分小動(dòng)脈內(nèi)膜增厚玻璃樣變性，內(nèi)徑狹窄。見圖1。

2.4腎臟病理損傷評價(jià)情況隨著觀察周期的延長，GSI、TIS均大致呈現(xiàn)上升趨勢。GSI在早期為逐漸上升，在第12、14周出現(xiàn)顯著上升；TIS在第8周時(shí)出現(xiàn)明顯升高，10 w時(shí)稍有下降，后呈逐漸上升趨勢。見表3。

2.5相關(guān)性分析以第8周作為慢性腎衰竭的觀察起點(diǎn)，分析血清及尿液AGT與各常規(guī)生化檢測指標(biāo)、血清、尿液AngⅡ及病理損傷指標(biāo)的相關(guān)性，見表4。血AGT與各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著相關(guān)性。尿AGT與Ccr呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.667，P<0.01)；與尿AngⅡ呈顯著正相關(guān)(r=0.497，P<0.01)；與GSI呈正相關(guān)(r=0.545，P<0.05)；與其他指標(biāo)無顯著相關(guān)性。

圖1　不同時(shí)期模型組大鼠腎小球及小管間質(zhì)病變情況

指標(biāo)組別第4周第6周第8周第10周第12周第14周GSI假手術(shù)組0.42±1.020.42±1.020.00±0.000.83±1.291.67±1.291.25±0.07模型組2.00±1.001)3.00±2.927.92±6.791)8.75±7.201)18.75±16.111)121.67±62.722)TIS假手術(shù)組0.00±0.000.05±0.050.10±0.090.13±0.180.10±0.150.07±0.10模型組0.10±0.130.43±0.381)1.95±1.302)1.27±0.742)2.40±0.862)3.67±1.142)

表4各檢測指標(biāo)與AGT的相關(guān)性分析

指標(biāo)血清AGTr值 P值尿液AGTr值 P值UTP(g/24h)-0.105>0.050.304>0.05Scr(μmol/L)-0.305>0.050.354>0.05BUN(mmol/L)-0.181>0.050.348>0.05Ccr(ml/min)-0.078>0.05-0.667<0.01血AngⅡ(pg/ml)0.039>0.050.027>0.05尿AngⅡ/Ucr(ng/gCr)0.044>0.050.497<0.01血AGT(ng/ml)0.149>0.05尿AGT/Ucr(μg/gCr)0.042>0.05GSI-0.121>0.050.545<0.05TIS-0.258>0.050.227>0.05

3討論

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)。近年來，大量的研究證據(jù)提示腎臟具有不依賴于循環(huán)RAS的局部RAS。AngⅡ作為RAS的主要效應(yīng)分子，參與了一系列生理及病理生理過程，如腎小球灌注壓的增加、腎小球細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的堆積等，腎臟局部RAS的激活在腎臟疾病的進(jìn)展過程中發(fā)揮了重要的作用。AGT是合成所有血管緊張素多肽所必需的底物，是一種糖基化的球蛋白，主要由肝臟合成〔6〕，由于AGT分子量大，循環(huán)中的AGT不能通過腎小球?yàn)V過屏障，所以尿AGT主要來源于腎臟，由近端腎小管合成分泌〔7〕，而與循環(huán)AGT無關(guān)〔8，9〕。其在腎素、ACE等的作用下形成AngⅡ，成為腎內(nèi)AngⅡ的主要來源，未轉(zhuǎn)化的AGT隨尿液排出體外。基于AGT的這一代謝特點(diǎn)，近年來引起了人們的關(guān)注。Kobori等〔9～11〕研究提示尿AGT與腎內(nèi)AngⅡ的活性相關(guān)，可能是腎內(nèi)RAS活性的評價(jià)指標(biāo)。章曉燕等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病患者尿AGT水平與腎內(nèi)AGT、AngⅡ和AngⅡ1型受體的免疫組化染色面積呈正相關(guān)，認(rèn)為尿AGT能較好地反映腎內(nèi)AngⅡ的活性，可作為腎內(nèi)AngⅡ活性的無創(chuàng)指標(biāo)。

臨床上，部分腎臟病人就診時(shí)已經(jīng)不具備腎穿刺活檢的條件，是否存在一種無創(chuàng)的手段或指標(biāo)來了解和判斷病人腎臟病理變化情況，尤其是對于判斷腎臟病是原發(fā)還是繼發(fā)于其他疾病的損害時(shí)顯得非常重要。本研究顯示血清AGT與各指標(biāo)間均無顯著相關(guān)性，尿AGT與尿AngⅡ呈顯著正相關(guān)，這與臨床研究〔12〕的結(jié)果相似，結(jié)果提示這兩者之間可能存在一定的聯(lián)系，由于尿中AngⅡ不僅來源與腎臟局部，還有部分來自于循環(huán)中經(jīng)腎小球?yàn)V過后自尿液排出，兩者之間的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)尿AGT與Ccr呈負(fù)相關(guān)，這與以往的研究結(jié)果〔12〕是一致的，提示尿AGT作為無創(chuàng)性指標(biāo)，能夠在一定程度上反映腎功能的情況；本研究提示傳統(tǒng)評價(jià)腎功能指標(biāo)對于腎功能預(yù)測準(zhǔn)確性較差。尿AGT與病理損傷指數(shù)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，尿AGT與GSI呈正相關(guān)，與TIS之間并無明顯相關(guān)性。關(guān)于病理損傷方面，有研究〔12〕發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病患者尿AGT與尿Ⅳ型膠原呈正相關(guān)，由于尿Ⅳ型膠原的水平能夠反映腎臟纖維化的程度，進(jìn)而推斷尿AGT的水平能夠反映腎臟纖維化的情況，即可能作為腎臟損傷尤其是慢性損傷程度的指標(biāo)。本研究通過腎臟病理切片直接觀察病變情況，可能較其具有較高的準(zhǔn)確性，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿AGT與TIS并無明顯的相關(guān)性，可能由于TIS本身包含3個(gè)方面內(nèi)容，并不單一反映腎間質(zhì)纖維化的情況。尿AGT與GSI呈正相關(guān)，由于局部RAS系統(tǒng)的激活會導(dǎo)致腎小球血流動(dòng)力學(xué)的改變以及AngⅡ介導(dǎo)的細(xì)胞表型改變和細(xì)胞增殖，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種生物活性物質(zhì)基因表達(dá)，這些過程可能都參與腎小球硬化的病理生理進(jìn)程〔13〕。尿AGT可以作為一個(gè)無創(chuàng)性指標(biāo)反映腎小球硬化的程度，具體的機(jī)制以及在人類是否具有類似的相關(guān)關(guān)系，還值得進(jìn)一步研究。

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〔2013-11-11修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)