扎里奴思方對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠P-糖蛋白的影響

李娟吳鵬1劉敬霞劉洋

(寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬國(guó)醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院，寧夏銀川750004)

摘要〔〕目的比較缺血損傷不同時(shí)段大鼠血腦屏障P-糖蛋白(P-gp) 時(shí)征表達(dá)及回藥扎里奴思方對(duì)其表達(dá)的影響。方法SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、扎里奴思方組，線栓法制備腦缺血再灌注模型，分別灌胃給藥，于缺血再灌注后1、3、7、14 d取腦，檢測(cè)大鼠腦皮質(zhì)及海馬區(qū)P-gp的表達(dá)。結(jié)果免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組與模型組大鼠腦皮質(zhì)及海馬缺血區(qū)均可見P-gp陽(yáng)性染色。與假手術(shù)組比較，不同再灌注時(shí)間模型組P-gp表達(dá)量均有顯著性差異( P<0.01) ，皮質(zhì)及海馬缺血區(qū)P-gp 表達(dá)量均升高;與模型組比較，扎里奴思方組及尼莫地平組大鼠腦皮質(zhì)及海馬區(qū)P-gp表達(dá)量明顯降低，尤以扎里奴思方3、14 d組為明顯(P<0.01) 。結(jié)論扎里奴思方發(fā)揮抗腦缺血損傷、神經(jīng)元保護(hù)作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)血腦屏障上P-gp的雙向表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞〔〕扎里奴思方；腦缺血再灌注損傷；血腦屏障；P-糖蛋白

中圖分類號(hào)〔〕R743〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81260569)；寧夏科技支撐計(jì)劃(No.2012ZYH230)

通訊作者：劉敬霞(1970-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)、回醫(yī)藥防治老年病研究。

1固原市人民醫(yī)院

第一作者：李娟(1987-)，女，碩士，主要從事中醫(yī)、回醫(yī)藥防治腦缺血性疾病的研究。

Effects of Zhalinusi Fang on the P-glycoprotein changes after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats

LI Juan, WU Peng,LIU Jing-Xia,etal.

Chinese Medicine Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia, China

Abstract【】ObjectiveTo research the P-glycoprotein(P-gp) expression on the blood-brain barrier at different times and the effect of Zhalinusi Fang after focal cerebral ischemia-reperfusion(I/R) in rats.MethodsSD rats were divided randomly into sham-operated，model，nimodipine and Zhalinusi Fang groups. Rat focal cerebral I/R model was established by middle cerebral artery occlusion with nylon thread.After rats were administered orally with corresponding drugs 1,3,7,14 d,the brain was taken out.Immunohistochemical method was used to detect P-gp expression in cerebral cortex and hippocampus.ResultsImmunohistochemical staining showed that in sham-operated and model groups, P-gp positive staining was visible at ischemic cerebral cortex and hippocampus region . Compared with that of sham-operated group, P-gp expressions of different reperfusion time model groups were significant different(P<0.01),P-gp expression at ischemic cortex and hippocampus were increased. Compared with those of model group, of P-gp expression at cerebral cortex and hippocampus of ZLNSF and nimodipine groups were significantly decreased (P<0.01).ConclusionsZhalinusi Fang could promote the cerebral protection,its mechanism may be related to bidirectional regulation the expression of P-gp at blood-brain barrier.

【Key words】Zhalinusi Fang(ZLNSF);Cerebral ischemia-reperfusion injury;Blood-brain barrier; P-glycoprotein

缺血性腦血管病是臨床多發(fā)病,可導(dǎo)致患者肢體功能缺損、生活質(zhì)量下降等嚴(yán)重后遺癥，危害著人類的健康?，F(xiàn)治療多從調(diào)控血腦屏障通透性方面進(jìn)行研究〔1〕。P-糖蛋白(P-gp)在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上有著高度的表達(dá)，是阻礙藥物傳遞入腦的主要物質(zhì)〔2〕。扎里奴思方是出自《回回藥方》治療腦病的常用方劑，本研究擬采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型進(jìn)一步、探討其發(fā)揮抗腦缺血損傷、神經(jīng)元保護(hù)作用是否通過調(diào)控血腦屏障上P-gp的表達(dá)變化實(shí)現(xiàn)的，為深入研究回族醫(yī)藥其腦保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物雄性SD大鼠，清潔級(jí)，3～4月齡，體重(300±50)g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：NXXY(寧)2001-0001。

1.2藥物扎里奴思方(出自《回回藥方》，方藥組成：安息香3 g、干祖伐(即懷牛膝)24 g、法里公(即茴香)、兀沙吉(即乳香)、法忒刺撒里榮(即當(dāng)歸)、木里葉(即沒藥)、撒法郎(即紅花)、蘆薈、伯思八牙(即水龍骨)、膃肭臍(即海狗腎)、阿夫忒蒙(即菟絲子)、石菖蒲各12 g、肉桂6 g、丹皮9 g)制劑由吳忠市回醫(yī)中醫(yī)院制劑室提供,方中所用生藥材去除雜質(zhì)，按組方劑量配比，煎煮濾取煎液后濃縮至藥液含生藥3.0 g/ml，4℃保存?zhèn)溆?；用前稀釋至生藥材含量?.5 g/ml。尼莫地平片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司提供，30 mg/片，批號(hào)：H20003010)，用蒸餾水配成混懸液(1.08 mg/ml)。

1.3主要試劑和儀器蒸餾水(寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);水合氯醛(上海五聯(lián)化工廠,分析純,蒸餾水配成10%溶液W/V);尼龍線(直徑0.26 mm，長(zhǎng)5 cm，用細(xì)砂紙打磨使頭端光滑、鈍圓、再用肝素溶液浸泡5 min,晾干,紫外線消毒備用)；電熱恒溫干燥箱(FX4-2，Shellab公司);電子天平(BT224S，Sartorius公司)；病理圖像分析軟件(技易科技)，P-gp(SC-673，稀釋至1∶64，試劑購(gòu)自Santa cruz Biotechnology)。

1.4分組與給藥隨機(jī)抽取10只作為假手術(shù)組，余成模后隨機(jī)分至模型、尼莫地平、扎里奴思方1、3、7、14 d組內(nèi)。所有動(dòng)物于成模清醒后2 h按相應(yīng)分組灌胃給藥,給藥劑量按動(dòng)物與人體表面積折算：扎里奴思方1.5 g/ml；尼莫地平1.08 mg/ml，模型組和假手術(shù)組以生理鹽水代替，1次/d。

1.5動(dòng)物模型的制備參照線栓法制備局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀?0%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后固定，頸正中切口，鈍性分離頸內(nèi)外動(dòng)脈，穿線備用；于頸外動(dòng)脈近動(dòng)脈分叉處剪口，穿入栓線，進(jìn)線長(zhǎng)度(19±2)mm，穿線成功后記錄時(shí)間，縫合皮膚，在2 h后進(jìn)行缺血再灌注，拔出栓線后縫合皮膚。假手術(shù)組只分離頸總、頸內(nèi)外動(dòng)脈，不穿入栓線。手術(shù)過程中保持大鼠肛溫(37.0±0.5)℃,保持室溫(26±1)℃。

1.6腦組織P-gp水平測(cè)定通過P-gp含量來(lái)評(píng)價(jià)血腦屏障通透性的變化。用Image Pro Plus 6.0圖像全自動(dòng)分析系統(tǒng)分析P-gp表達(dá)。測(cè)出iod sum和area sum值，取其平均值，平均光密度值=iod sum/area sum，反映P-gp含量的表達(dá)。

2結(jié)果

假手術(shù)組與模型組大鼠腦皮質(zhì)及海馬缺血區(qū)均可見P-gp陽(yáng)性染色。與假手術(shù)組比較，不同再灌注時(shí)間模型組P-gp 表達(dá)量均有顯著升高(P<0.01)，皮質(zhì)及海馬缺血區(qū)P-gp表達(dá)量顯著升高與模型組比較，扎里奴思方組及尼莫地平組大鼠腦皮質(zhì)及海馬區(qū)P-gp 表達(dá)量明顯降低，尤以扎里奴思方3、14 d組、尼莫地平7 d組最明顯(P<0.01) 。組內(nèi)比較：與模型1 d組相比，3 d組P-gp表達(dá)明顯增加達(dá)高峰，7～14 d其含量逐漸回落；扎里奴思方與尼莫地平組3 d達(dá)高峰至7、14 d P-gp表達(dá)呈逐漸降低趨勢(shì)(P<0.05，P<0.01)。見表1。

組別1d3d7d14d假手術(shù)組83.43±13.8483.43±13.8483.43±13.8483.43±13.84模型組138.075±9.881)153.853±3.181)5)146.41±17.131)5)6)145.59±8.461)5)6)尼莫地平組137.83±4.051)146.78±18.701)2)5)129.39±11.911)2)5)6)119.22±8.251)2)5)6)扎里奴思方組127.89±17.231)142.69±9.121)2)3)5)140.34±15.841)2)4)5)117.13±9.101)2)5)6)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05；與尼莫地平組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與1 d組比較：5)P<0.01；與3 d組比較：6)P<0.01

3討論

血腦屏障(BBB)是腦與血液及腦脊液之間的一種屏障,與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變性、損傷密切相關(guān)。其阻礙機(jī)制通常分為兩部分〔3，4〕：①結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的，對(duì)于大分子物質(zhì)的物理屏障；②由其上面的多種信號(hào)物質(zhì)導(dǎo)致的，對(duì)小分子物質(zhì)起作用的化學(xué)電荷屏障。P-gp在維持BBB屏障功能、保持腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、限制外源性毒物或藥物進(jìn)入方面有重要作用,但同時(shí)也限制了治療性藥物在腦內(nèi)的濃度,從而使治療效果減弱〔5～9〕。在缺血中風(fēng)性疾病中，深入研究P-gp功能及作用機(jī)制有助于選擇性調(diào)控BBB功能,對(duì)提高腦內(nèi)藥物的濃度和中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的生物利用度具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腦缺血后模型組呈現(xiàn)了針對(duì)腦損傷的P-gp反應(yīng)性表達(dá)增加又逐漸下降趨勢(shì)，藥物組的表達(dá)趨勢(shì)相同；但是，腦缺血治療引起的P-gp表達(dá)量改變及持續(xù)時(shí)間均顯示治療后P-gp的表達(dá)對(duì)缺血損傷的神經(jīng)元起到了全面而持久的保護(hù)作用〔10，11〕。因此，采用可調(diào)控P-gp雙向表達(dá)的治療措施，對(duì)缺血后神經(jīng)元損傷的保護(hù)具有重要意義。前期研究〔12～14〕發(fā)現(xiàn)，扎里奴思方具有抗腦缺血損傷、神經(jīng)元保護(hù)作用。本研究進(jìn)一步顯示：扎里奴思方在一定時(shí)限可以促進(jìn)大鼠腦缺血再灌注損傷后P-gp的表達(dá)，加強(qiáng)有害物質(zhì)的外排；然而在缺血再灌注損傷3 d后，其表達(dá)又趨于抑制，P-gp的表達(dá)量急速回落，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其抑制作用逐步增強(qiáng)，而這種變化趨勢(shì)與腦缺血后BBB通透性的變化幾乎一致〔15〕。

扎里奴思方具有芳香開竅、益髓補(bǔ)腎、活血祛瘀等作用，切中腦中風(fēng)后痰蒙神竅、氣虛血瘀等諸病機(jī)，有很好的抗缺血損傷、神經(jīng)元保護(hù)作用，后期可以減輕缺血腦組織中P-gp的滲出，減少治療性的藥物外排，增加藥物在腦內(nèi)濃度，從而起到BBB保護(hù)性治療作用，還可以減少有害物質(zhì)的進(jìn)入和腦實(shí)質(zhì)水腫的發(fā)生，改善受損神經(jīng)功能恢復(fù)。本文結(jié)果也顯示扎里奴思方可有效改善術(shù)后大鼠腦組織病理?yè)p傷和促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，且其作用隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)而逐步增強(qiáng)，其變化趨勢(shì)與P-gp變化趨勢(shì)一致，本文可認(rèn)為扎里奴思方對(duì)腦缺血再灌注后腦組織的保護(hù)作用可能是通過調(diào)節(jié)BBB中P-gp的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

4參考文獻(xiàn)

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15Jin XC,Liu J,Yang Y,etal.Spatiotemporal evolution of blood brain barrier damage and tissue infarction within the first 3 h after ischemia onset〔J〕.Neurobiol Dis,2012;48(3):309-16.

〔2013-11-15修回〕

(編輯曲莉)