左歸降糖清肝方含藥血清對脂肪酸孵育的HepG2細(xì)胞脂肪變性的影響

成細(xì)華喻嶸胡偉1唐元2羅文娟2曾辛程莉娟

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208)

摘要〔〕目的探討左歸降糖清肝方含藥血清對脂肪酸孵育的人肝細(xì)胞株(HepG2)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量的影響。方法用混合脂肪酸孵育的HepG 2 細(xì)胞建立細(xì)胞脂肪變性模型；將實(shí)驗(yàn)分為正常組，模型組，5%、10%、15%含藥血清組，油紅O染色法檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，同時定量檢測細(xì)胞內(nèi)TG含量。結(jié)果0.5 mmol/L 混合脂肪酸孵育HepG2細(xì)胞24 h，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)TG大量沉積，而10%、15% 左歸降糖清肝方含藥血清可抑制脂肪酸這一效應(yīng)，使細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯下降(P<0.01)。結(jié)論左歸降糖清肝方含藥血清可改善脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪變性。

關(guān)鍵詞〔〕左歸降糖清肝方；HepG2細(xì)胞；脂肪變性；甘油三酯

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81102593，81273753);地方高校國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(No.201210541003);中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)湖南省重點(diǎn)學(xué)科資助

通訊作者：程莉娟(1979-)，女，副教授，主要從事中醫(yī)藥防治糖尿病機(jī)制的研究。

1湖南省工傷康復(fù)中心2湖南中醫(yī)藥大學(xué)2012級研究生

第一作者：成細(xì)華(1974-)， 女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治糖尿病機(jī)制的研究。

Effect of Zuogui Jiangtang Qinggan Recipe on steatosis in HepG2 cells induced by fatty acid

CHENG Xi-Hua, YU Rong,HU Wei,etal.

Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, Hunan, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of Zuogui Jiangtang Qinggan Recipe (ZJQR) on triglyceride(TG) accumulation in HepG2 cells induced by fatty acid mixed.MethodsThe cell model of steatosis was established by fatty acid mixed in HepG2 cells. The experiments were divided into control, model, 5%, 10%, 15% medicated serum groups. The amount of TG in HepG2 cells was quantitatively analyzed by oil red O staining method.ResultsThe fatty acid mixed (0.5 mmol/L) resulted in significant steatosis in HepG2 cells. The 10%, 15% medicated serum inhibited the effect of the fatty acid mixed, and significantly reduced the intracellular TG content.ConclusionsZJQR is able to ameliorate the excessive TG accumulation in HepG2 cells induced by fatty acid mixed.

【Key words】Zuogui Jiangtang Qinggan Recipe(ZJQR); HepG2 cells;Steatosis;Triglyceride

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)為肝病領(lǐng)域的主要熱點(diǎn)〔1〕。左歸降糖清肝方具有滋陰益氣、活血解毒之功效。前期研究表明，其能有效改善高脂飲食轉(zhuǎn)基因2型糖尿病雙受體功能缺損(MKR)鼠空腹血糖、血脂、肝功能指標(biāo)、肝質(zhì)量和肝指數(shù)，改善肝臟脂肪性變〔2〕。本文采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合中藥血清藥理學(xué)方法，以混合脂肪酸誘導(dǎo)人肝細(xì)胞株HepG2細(xì)胞脂肪變性模擬NAFLD形成，觀察左歸降糖清肝方對脂肪酸孵育的HepG2細(xì)胞甘油三酯(TG)含量的影響，從體外進(jìn)一步揭示左歸降糖清肝方的降脂作用。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動物HepG2細(xì)胞株購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫。清潔級SD大鼠，動物合格證號：SYXK(湘)2009-0001，體重250～300 g，雌雄不拘，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心，用于制備含藥血清。

1.2藥物左歸降糖清肝方中藥購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)杏林藥號。煎2次，合并煎液，過濾濃縮至生藥1 g/ml，4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3主要試劑DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，0.25% 胰蛋白酶(Gibco，美國)，油酸、棕櫚酸(Sigma，美國)，TG試劑盒(南京建成生物工程研究所，F(xiàn)001-1)。

1.4左歸降糖清肝方含藥血清的制備40只SD大鼠隨機(jī)分為兩組，每組20只。左歸降糖清肝方按臨床體表面積換算，以生藥59.28 g/kg，2次/d灌胃，連續(xù)7 d；對照組給予等體積蒸餾水。第7天給藥后1 h，腹主動脈插管采血，室溫靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，取上清，56℃滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾滅菌，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们坝肈MEM培養(yǎng)基稀釋成體積分?jǐn)?shù)含藥血清。

1.5濃度血清制備胎牛血清組為15%胎牛血清DMEM；正常組為15%正常大鼠血清DMEM；5%、10%、15%含藥血清組為終濃度5%、10%、15% 含藥血清，血清濃度不足用無藥血清補(bǔ)至15%。

1.6細(xì)胞培養(yǎng)與傳代HepG2細(xì)胞用培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液+15% 胎牛血清+青霉素 100 U/ml，鏈霉素0.1 mg/ml)在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h更換培養(yǎng)液，細(xì)胞約80%～90% 融合度時，用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞并傳代。

1.7噻唑藍(lán)(MTT)法檢測不同濃度含藥血清對HepG2細(xì)胞活力的影響HepG2細(xì)胞分為胎牛血清組，無藥血清組和5%、10%、15%含藥血清組。15%DMEM培養(yǎng)HepG2細(xì)胞12 h，待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液。每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，用 MTT法測定細(xì)胞存活率。酶聯(lián)免疫檢測儀測定光吸收值(波長490 nm)。左歸降糖清肝方含藥血清對HepG2細(xì)胞存活率=OD含藥血清/OD無藥血清×100%。

1.8肝細(xì)胞脂肪變性模型建立HepG細(xì)胞用含0.5 mmol/L混合脂肪酸(OA∶PA=2∶1)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12、24、36 h。

1.9分組及干預(yù)將細(xì)胞分為正常組，模型組，5%、10%、15%含藥血清組。培養(yǎng)HepG2細(xì)胞12 h，待細(xì)胞貼壁后，更換相應(yīng)培養(yǎng)液。模型組，5%、10%、15% 含藥血清組同時加混合脂肪酸至終濃度0.5 mmol/L。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.10細(xì)胞內(nèi)脂滴變化檢測細(xì)胞接種于蓋玻片上，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍，4% 多聚甲醛固定10 min，風(fēng)干細(xì)胞爬片。PBS洗爬片2次，3 min/次；油紅O染液閉光染色20 min；60%異丙醇沖洗30 s；蘇木精細(xì)胞核復(fù)染；蒸餾水洗30 s至背景透明，甘油封片，將爬片置于顯微鏡下拍照。

1.11細(xì)胞內(nèi)TG水平測定胰蛋白酶消化，1 000r/min離心5 min收集細(xì)胞；加入500 μl異丙醇冰上靜置抽提2 h，-4℃，16 000 r/min離心10 min。取上清真空抽干，用20 μl異丙醇溶解，按試劑盒說明測定TG含量，二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白含量。結(jié)果表示為每克細(xì)胞總蛋白中所含的TG量(mg/g)。

2結(jié)果

2.1左歸降糖清肝方含藥血清對HepG2細(xì)胞活力的影響以15%無藥血清DMEM或15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，細(xì)胞生長及形態(tài)均正常。15%無藥血清組OD490為0.342±0.031，存活率100%；15%胎牛血清組OD490為0.352±0.022，存活率102.9%，兩者比較無明顯差異(P>0.05)。5%、10%、15%、20%含藥血清OD490為0.334±0.010,0.329±0.025,0.334±0.027,0.252±0.012。與無藥血清組比較，5%、10%和15%含藥血清組HepG2細(xì)胞存活率(97.7%，96.3%，97.7%)沒有明顯變化(P>0.05)，而20%含藥血清細(xì)胞存活率(73.7%)下降(P<0.01)。

2.2培養(yǎng)時間對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響油紅O染色，將細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的脂滴沉積染成紅色，細(xì)胞內(nèi)紅色顯影出現(xiàn)比例越高，提示細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積越多。0.5 mmol/L混合脂肪酸(OA∶PA=2∶1)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞12、24、36 h后，細(xì)胞內(nèi)脂滴脂滴含量呈時間依賴性增加。相同時間點(diǎn)與正常培養(yǎng)HepG2細(xì)胞比較，脂滴堆積明顯增加。見圖1。

2.3左歸降糖清肝方對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響模型組HepG2細(xì)胞經(jīng)油酸誘導(dǎo)24 h后，與正常組比較，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了大量的脂滴沉積，5%、10%和15%含藥血清處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的脂滴呈劑量依賴性減少。見圖2。

圖1　混合脂肪酸誘導(dǎo)對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響(油紅O染色，×250)

圖2　左歸降糖清肝方對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響(油紅O染色，×250)

2.4左歸降糖清肝方對HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響左歸降糖清肝方均能降低脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量。與模型組〔(275.3±11.6)mg/g〕比較，10%和15%含藥血清處理的HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量〔(224±16.7)、(213±11.2)mg/g〕降低(P<0.01)。正常組TG含量(185±13.1)mg/g,5%含藥血清能降低HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量〔(250.1±23.8)mg/g〕，但與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

NAFLD的治療缺乏特效藥物，治療重點(diǎn)在于消除或控制與相關(guān)的因素，如糖尿病、高血脂、肥胖等。主要措施包括控制飲食，適度運(yùn)動，改變不良行為、減肥、積極控制糖尿病和高脂血癥等，但是采用藥物干預(yù)抑制脂肪肝的發(fā)生、發(fā)展也是目前面臨的任務(wù)，而中醫(yī)藥在治療NAFLD方面顯示了較好的優(yōu)勢〔3,4〕。

根據(jù)滋陰益氣活血化瘀法組方的左歸降糖清肝方，在臨床治療糖尿病合并脂肪肝有明顯療效，在餐后2 h血糖、血脂、肝功能、肝臟彩超及總體療效方面明顯優(yōu)于對照組〔5〕。在動物實(shí)驗(yàn)方面，其能減輕高脂飲食加劇的MKR小鼠的胰島素抵抗(IR)，降低血糖、血脂水平，其機(jī)制與調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)繳(ERS)，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝密切相關(guān)〔2,6,7〕。本實(shí)驗(yàn)中，15% 左歸降糖清肝方含藥血清可干預(yù)混合脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)沉積，減少TG含量。

綜上所述，在接近NAFLD病理狀態(tài)的體外模型中，證實(shí)了左歸降糖清肝方對肝細(xì)胞脂肪變性有改善作用，但具體的分子機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。

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〔2013-12-17修回〕

(編輯袁左鳴)