加味五苓散對(duì)糖尿病神經(jīng)源性膀胱模型大鼠的預(yù)防性作用

劉煜洲李日東李賽美1操紅纓2劉超男李陽(yáng)

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405)

摘要〔〕目的探討加味五苓散對(duì)糖尿病神經(jīng)源性膀胱模型大鼠的預(yù)防性作用。方法將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和加味五苓散高、中、低劑量組，采用高脂高糖飲食配合腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型，從行為學(xué)、組織形態(tài)學(xué)、尿動(dòng)力學(xué)等方面對(duì)于加味五苓散預(yù)防性干預(yù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果經(jīng)過(guò)糖尿病造模各組與空白組相比，出現(xiàn)明顯糖尿病征象，在血糖、體重、飲水量、食量、尿量等指標(biāo)上均有顯著差異(P<0.05)；光鏡下模型組大鼠膀胱組織可見(jiàn)肌纖維排列紊亂，肌細(xì)胞形態(tài)各異，肌束間隙增寬等糖尿病神經(jīng)源性膀胱典型病理狀態(tài)，中藥干預(yù)各組肌纖維排列、肌束間隙等病理狀態(tài)均有所改善；尿動(dòng)力學(xué)方面，中劑量組大鼠在排尿時(shí)間和順應(yīng)性等指標(biāo)上優(yōu)于模型組(P<0.05)。結(jié)論加味五苓散預(yù)防性給藥對(duì)糖尿病神經(jīng)源性膀胱大鼠的膀胱組織有一定保護(hù)和修復(fù)作用，其預(yù)防機(jī)制可能與改善模型大鼠的逼尿肌功能有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕加味五苓散；糖尿病神經(jīng)源性膀胱；膀胱組織形態(tài)學(xué)；尿動(dòng)力學(xué)

中圖分類號(hào)〔〕R256.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)

通訊作者：李賽美(1960-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事經(jīng)方治療疑難癥研究。

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院2廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院

第一作者：劉煜洲(1987-)，男，博士，主要從事經(jīng)方治療疑難癥研究。

Preventive efficacy of Jiawei Wuling powder on rats in diabetic bladder dysfunction

LIU Yu-Zhou，LI Ri-Dong, LI Sai-Mei,etal.

Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, Guangdong, China

Abstract【】ObjectiveTo assess preventive effect of Jiawei Wuling powder on rats with diabetic bladder dysfunction.MethodsFive groups were set up. Diabetes model rats were induced by high-fat diet and Streptozotocin (STZ) intraperitoneal injection. The evaluation included ways of animal ethology, histomorphology and urine dynamics.ResultsThe diabetic model groups had typical “a little more than three disease” syndrome. Meanwhile, the model control group rats had muscles derangement, abnormal muscle cell form and widen muscle bundle under optical microscope. However the herbal medicine groups showed ameliorating pathological state. The rats in moderate dose group were superior to those of model control group in voiding time and compliance(P<0.05).ConclusionsPreventive administration Jiawei Wuling powder could ameliorate rats' detrusor function and protect bladder tissue.

【Key words】Jiawei Wuling powder；Diabetic bladder dysfunction；Bladder histomorphology；Urine dynamics

糖尿病神經(jīng)源性膀胱，主要表現(xiàn)為膀胱儲(chǔ)尿和排泄的雙重障礙，包括膀胱感覺(jué)功能障礙、尿潴留、排尿困難和逼尿肌功能紊亂等〔1,2〕，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前研究認(rèn)為其與膀胱逼尿肌、尿道、自主神經(jīng)和尿路上皮等結(jié)構(gòu)的功能紊亂有關(guān)〔3〕。當(dāng)代中醫(yī)學(xué)者多從理論闡述、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)等角度研究該病，少見(jiàn)RCT臨床試驗(yàn)和作用機(jī)制研究〔4〕。廣州中醫(yī)藥大學(xué)李賽美教授根據(jù)該病出現(xiàn)排尿異常之體征及“久病脾腎陽(yáng)虛”之病機(jī)，在《傷寒論》專治“小便不利”的千古名方——五苓散〔5〕基礎(chǔ)上，組方加味五苓散，意在扶正固本，溫陽(yáng)化氣，通調(diào)水道。前期研究顯示該方不僅能有效地改善患者的排尿癥狀，同時(shí)對(duì)尿路逆行感染有一定的防治作用〔6～8〕。本文運(yùn)用加味五苓散對(duì)糖尿病神經(jīng)源性膀胱模型大鼠進(jìn)行預(yù)防性給藥干預(yù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0034；實(shí)驗(yàn)大鼠均在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房進(jìn)行飼養(yǎng)，屏障環(huán)境符合SPF級(jí)要求，許可證號(hào)：SYXK(粵)2013-0001。

1.2試劑與儀器鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)sigma公司)；檸檬酸；檸檬酸鈉；雅培安妥血糖儀及血糖試紙，尿動(dòng)力學(xué)分析儀(Laborie公司)，組織脫水機(jī)(Leica TP1020)、石蠟包埋機(jī)(Leica EG1160)、病理組織切片機(jī)(Leica 2135)、多功能自動(dòng)染色機(jī)(Leica ST5010)、顯微鏡(Leica DMR)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1加味五苓散制備加味五苓散組成為茯苓18 g、豬苓18 g、澤瀉30 g、桂枝12 g、白術(shù)18 g、烏藥10 g、炮附子10 g(先煎)、黃芪30 g，均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房購(gòu)自廣東省藥材公司中藥飲片廠，后將藥材置不銹鋼夾層鍋內(nèi)，加純化水超過(guò)藥材面10 cm，浸泡30 min，熟附子先煎30 min，余藥材放入，通蒸汽煮沸1 h；取出首次煎煮藥液；再將藥渣進(jìn)行第2次煎煮，時(shí)間1 h，合并2次煎煮提取藥液，濾過(guò)濃縮制成生藥含量1 g/ml的藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?，以上工序均委托廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房完成。

1.3.2動(dòng)物模型制備實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，除空白組正常飼養(yǎng)外，糖尿病模型各組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4 w后，均按體重一次性腹腔注射45 mg/kg的1% STZ溶液(溶解STZ的緩沖液由檸檬酸和檸檬酸鈉按照1∶1.32的比例配置，pH4.2)，3 d后剪尾取血，血糖儀測(cè)量血糖>16.7 mmol/L說(shuō)明糖尿病模型大鼠成功造模。

1.3.3分組和給藥將70只SD大鼠隨機(jī)分為空白組10只，模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組各15只。加味五苓散高、中、低劑量組經(jīng)換算分別每日灌胃加味五苓散水煎液6 ml、3 ml、1.5 ml，連續(xù)灌胃8 w。

1.3.4觀察指標(biāo)

1.3.4.1一般行為學(xué)觀察觀察動(dòng)物毛色、活動(dòng)度、飲水、進(jìn)食、體重、精神狀態(tài)等，

1.3.4.2血糖及代謝狀況監(jiān)測(cè)定期監(jiān)測(cè)大鼠血糖，24 h代謝籠檢測(cè)大鼠食量、尿量、飲水量等代謝指標(biāo)。

1.3.4.3尿動(dòng)力學(xué)測(cè)定各組大鼠腹腔注射25%烏拉坦0.4 mg/kg，取下腹部切口實(shí)施膀胱頂造瘺，插入導(dǎo)管后封瘺口，導(dǎo)管經(jīng)三通管連接尿動(dòng)力儀和微量灌注泵，排空大鼠膀胱尿液后，微量灌注泵以30 ml/h的速率向膀胱灌注20℃～22℃生理鹽水，當(dāng)大鼠出現(xiàn)排尿反應(yīng)時(shí)，停止灌注生理鹽水。記錄排尿時(shí)間、逼尿肌壓等，計(jì)算出膀胱順應(yīng)性。

1.3.4.4膀胱組織形態(tài)學(xué)觀察各組大鼠處死后取出膀胱組織，4%多聚甲醛固定，無(wú)水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成約3 μm的組織片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡觀察。

2結(jié)果

2.1一般行為學(xué)觀察空白組大鼠飲食正常，體重穩(wěn)步增長(zhǎng)，毛色均勻致密，有光澤。其余各組大鼠經(jīng)糖尿病造模后均出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿的典型糖尿病癥狀，伴有精神不振、活動(dòng)度低、毛色稀疏晦暗等?？瞻捉M大鼠無(wú)死亡，其余各組死亡數(shù)分別為7只、8只、7只和3只，可能與藥物注射導(dǎo)致胰島細(xì)胞過(guò)度破壞、大鼠難以耐受長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)等因素有關(guān)。

第0周時(shí)，各組大鼠體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)，組間具有可比性。第4周即注射完STZ的第1周時(shí)，僅有中劑量組大鼠與空白組大鼠有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而在第8周和第13周時(shí)，糖尿病造模的各組大鼠體重均較空白組大鼠低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組別n第0周第4周第8周第13周空白組10220.90±25.60314.10±24.93431.77±43.36485.37±48.93模型組8210.43±16.40295.71±19.70,333.35±43.521)303.62±43.561)高劑量組7216.71±18.05291.57±29.001)335.00±18.851)338.31±55.321)中劑量組8213.38±23.49274.00±29.22302.95±54.021)283.48±55.401)低劑量組12217.50±8.76294.58±26.01284.73±24.791)295.90±52.401)

與空白組比較：1)P<0.05；表2、表3同

2.2加味五苓散對(duì)血糖的影響造模第0周，也就是STZ注射第3天時(shí)，糖尿病造模各組大鼠血糖顯著上升，與空白組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。提示本次實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制糖尿病大鼠模型。各組大鼠血糖在造模不同時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著差異，提示糖尿病大鼠模型穩(wěn)定(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3代謝指標(biāo)統(tǒng)計(jì)24 h代謝籠結(jié)果顯示至第9周時(shí)糖尿病造模各組大鼠的食量、尿量和飲水量均較空白組大(P<0.01)。其中中劑量組食量、尿量和飲水量較各組有改善趨勢(shì)，但與模型組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

組別n造模第0周造模第1周造模第3周造模第5周造模第7周造模第9周空白組105.98±0.716.61±0.725.84±0.805.86±2.024.22±0.695.16±0.62模型組823.07±4.881)24.20±7.491)21.37±4.411)27.28±0.911)23.58±3.751)27.80±0.001)高劑量組724.80±3.151)24.92±7.591)23.54±4.191)27.80±0.001)22.61±2.741)27.80±0.001)中劑量組819.82±7.511)24.52±6.671)24.62±4.021)27.31±0.731)21.62±5.311)26.62±2.001)低劑量組1223.47±6.161)26.07±5.971)25.64±2.531)27.80±0.001)24.97±2.621)27.43±0.871)

根據(jù)雅培安妥血糖儀說(shuō)明書(shū)，該血糖儀測(cè)量上限為27.8 mmol/L，高于該值則血糖儀顯示為“H”，因此部分組別血糖統(tǒng)計(jì)為(27.8±0.00)mmol/L

組別n 造模第5周 造模第9周 尿量食量飲水量尿量食量飲水量空白組1026.50±9.8828.21±6.0537.90±18.3528.60±6.9728.19±5.7536.60±14.48模型組898.71±23.441)27.80±6.58117.42±33.21)175.71±29.311)37.18±5.711)205.71±23.471)高劑量組788.40±27.941)21.24±987114.80±26.51)199.60±11.261)38.12±3.091)218.80±1.791)中劑量組873.57±31.701)21.30±5.1881.57±31.831)162.40±44.521)32.88±4.63195.66±35.011)低劑量組12110.90±31.51)30.97±5.54129.60±23.041)187.00±11.361)39.65±3.381)219.60±0.841)

2.4尿動(dòng)力學(xué)與空白組相比，模型組呈現(xiàn)排尿時(shí)間延長(zhǎng)、順應(yīng)性增高等特點(diǎn)，兩者相比具有顯著性差異。中藥各組和模型組相比，中劑量組大鼠排尿時(shí)間和順應(yīng)性優(yōu)于模型組(P<0.05)；高劑量組和低劑量組和模型組相比，排尿時(shí)間和順應(yīng)性有減少的趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

2.5膀胱組織形態(tài)學(xué)結(jié)果光鏡下顯示：空白組大鼠膀胱逼尿肌纖維排列規(guī)整，肌細(xì)胞大小及形態(tài)正常。模型組可見(jiàn)膀胱壁增厚、肌纖維排列紊亂、肌細(xì)胞形態(tài)各異、肌束間隙增寬等病理狀態(tài)，出現(xiàn)糖尿病神經(jīng)源膀胱典型病理改變。中藥干預(yù)各組可見(jiàn)部分肌纖維排列較亂，但較模型組相比，肌纖維排列、肌束間隙等病理狀態(tài)均有所改善。見(jiàn)圖1。

組別n排尿時(shí)間(s)最大逼尿肌壓(mmH2O)順應(yīng)性(s/mmH2O)空白組102.17±1.3465.19±5.001.67±1.07模型組85.66±2.431)55.09±14.421)5.53±2.811)高劑量組75.39±3.111)55.42±7.591)4.84±2.901)中劑量組82.88±1.822)52.47±7.402.66±1.402)低劑量組124.87±2.871)56.77±10.341)4.24±3.261)

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

圖1　各組膀胱組織光鏡觀察結(jié)果

3討論

糖尿病神經(jīng)源性膀胱是常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)該病發(fā)生發(fā)展過(guò)程缺乏全面了解，除降糖、排尿訓(xùn)練、間歇性清潔導(dǎo)尿等基礎(chǔ)治療外，尚未有特效的治療藥物。本研究在《傷寒論》名方“五苓散”基礎(chǔ)上，結(jié)合李賽美教授臨床經(jīng)驗(yàn)組成加味五苓散，強(qiáng)化原方溫陽(yáng)益氣之效，前期臨床研究已證實(shí)對(duì)于糖尿病神經(jīng)源性膀胱治療具有很好的療效。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠逼尿肌功能受損，總之，本研究已經(jīng)成功復(fù)制糖尿病神經(jīng)源性膀胱大鼠模型，為進(jìn)一步研究打下良好的基礎(chǔ)。加味五苓散對(duì)于糖尿病神經(jīng)源性膀胱模型大鼠膀胱組織具有一定的保護(hù)和修復(fù)作用，尿動(dòng)力結(jié)果提示加味五苓散可改善大鼠逼尿肌功能。

本研究表明加味五苓散預(yù)防性干預(yù)可在不影響血糖的基礎(chǔ)上，改善糖尿病神經(jīng)源性膀胱模型大鼠膀胱逼尿肌功能，延緩逼尿肌相關(guān)病理改變，對(duì)于預(yù)防糖尿病神經(jīng)源性膀胱的發(fā)生發(fā)展有一定作用。但本研究存在實(shí)驗(yàn)大鼠死亡率偏高，未使用降糖藥物作為基礎(chǔ)干預(yù)手段等不足。未來(lái)擬在該方與降糖藥協(xié)同作用、分子作用機(jī)制、方藥量效等方面進(jìn)行進(jìn)一步研究，從而為加味五苓散防治糖尿病神經(jīng)源性膀胱提供更多證據(jù)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2013-11-09修回〕

(編輯袁左鳴)