食管鱗狀細(xì)胞癌組織ULBP3的表達(dá)及與NK細(xì)胞的相關(guān)性

房新輝楊玉秀

(河南省人民醫(yī)院鄭州大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南鄭州450003)

摘要〔〕目的探討食管鱗狀細(xì)胞癌組織UL16結(jié)合蛋白(ULBP)3的表達(dá)及與自然殺傷(NK)細(xì)胞的相關(guān)性。方法選取2012年1月至2013年12月在該院就診的食管鱗狀細(xì)胞癌患者48例，取食管鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁組織標(biāo)本及外周血，采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本中ULBP3的表達(dá)，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定NK細(xì)胞的含量，分析ULBP3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及與NK細(xì)胞的相關(guān)性。結(jié)果ULBP3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05)；食管鱗狀細(xì)胞癌組織中ULBP3的表達(dá)與外周血NK細(xì)胞含量呈正相關(guān)(r=0.596，P<0.05)；ULBP3的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論食管鱗狀細(xì)胞癌組織ULBP3高表達(dá)，且可能和NK細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程相關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕食管鱗狀細(xì)胞癌；UL16結(jié)合蛋白3；自然殺傷細(xì)胞

中圖分類號(hào)〔〕R735〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

通訊作者：楊玉秀(1955-)，男，碩士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事消化道腫瘤方面的研究。

第一作者：房新輝(1981-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤方面的研究。

食管鱗狀細(xì)胞癌表現(xiàn)為角質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞之間存在細(xì)胞間橋或伴有角化〔1〕。自然殺傷(NK)細(xì)胞是機(jī)體遺傳性免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)病原體感染及惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有自然細(xì)胞毒效應(yīng)。NK細(xì)胞活化性受體(NKG2D)的配體在惡性腫瘤中有廣泛表達(dá)，可能和惡性腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移相關(guān)〔2〕。UL16結(jié)合蛋白(ULBP)3是NKG2D的配體之一，主要表達(dá)于應(yīng)激條件下的腸黏膜上皮細(xì)胞和上皮源性的腫瘤細(xì)胞〔3〕。本研究擬分析ULBP3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其與NK細(xì)胞的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1一般資料選取2012年1月至2013年12月在我院就診的經(jīng)病理檢查確診為食管鱗狀細(xì)胞癌患者48例，在就診前均未行化、放療。年齡60～79〔平均(67.23±6.12)〕歲，男34例，女14例，腫瘤直徑1.1～10.0 cm；腫瘤位置食管上段17例，中下段31例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例；TNM分期：Ⅰ期+Ⅱ期25例，Ⅲ期+Ⅳ期23例；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)14例，Ⅱ級(jí)24例，Ⅲ級(jí)10例。取患者食管鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本，同時(shí)取食管鱗狀細(xì)胞癌患者的癌旁正常組織作為對(duì)照，另每例患者取外周血5 ml。ULBP3兔抗人多克隆抗體及免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)公司，CD3-F1TC抗體、CD16/56-PE抗體、CD45-PC7抗體購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司。

1.2方法

1.2.1鏈霉菌抗生物蛋白(SP)免疫組化法采用SP免疫組化法測(cè)定ULBP3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁組織的表達(dá)，將食管鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本用石蠟包埋后備用，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。每份石蠟標(biāo)本取3份切片進(jìn)行連續(xù)性切片，脫蠟、水化。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。進(jìn)行微波抗原修復(fù)，加入一抗后4℃過(guò)夜，再加入抗一抗的二抗后常溫孵育30 min，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液進(jìn)行顯色再用HE復(fù)染。用已知的陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：在400倍光鏡下觀察記錄免疫組化結(jié)果，每份切片取10個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行雙人雙盲計(jì)數(shù)，記錄切片中陽(yáng)性細(xì)胞占同類觀察細(xì)胞總數(shù)的百分比及著色深度。ULBP3定位在細(xì)胞質(zhì)中，劃分為4個(gè)等級(jí)；陰性(-)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于觀察細(xì)胞總數(shù)的10%；陽(yáng)性(+)：著色為淺黃色，且染色細(xì)胞數(shù)占觀察細(xì)胞總數(shù)10%～30%；中度陽(yáng)性()：著色為黃色或深黃色，染色細(xì)胞數(shù)占觀察細(xì)胞總數(shù)30%～60%；強(qiáng)陽(yáng)性()：細(xì)胞著色為褐色或棕褐色，染色細(xì)胞數(shù)占觀察細(xì)胞總數(shù)60%以上。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血NK細(xì)胞的含量，每例患者取外周血4 ml行肝素鈉抗凝處理，通過(guò)葡聚糖泛影葡胺密度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，吸取100 μl外周血單個(gè)核細(xì)胞加入流式管中，再加入CD3-F1TC抗體、CD16/56-PE抗體、CD45-PC7抗體各5 μl，孵育15 min，用PBS洗滌1～2次，用多聚甲醛固定后上機(jī)檢測(cè)。采用Cell quest軟件分析外周血CD16+CD56+CD3+NK細(xì)胞占CD45+NK細(xì)胞的比例。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2分析，等級(jí)資料表達(dá)陽(yáng)性強(qiáng)度比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)。

2結(jié)果

2.1ULBP3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，ULBP3在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，且ULBP3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織(“-”12 vs 33例，“+”10 vs 5例，“”12 vs 6例，“”14 vs 4例)(Z=11.378，P<0.05)。

2.2ULBP3表達(dá)和NK細(xì)胞含量在食管鱗狀細(xì)胞癌組織的相關(guān)性48例食管鱗狀細(xì)胞癌患者外周血標(biāo)本NK細(xì)胞含量為(17.83±6.48)%，Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中ULBP3的表達(dá)和外周血NK細(xì)胞含量呈正相關(guān)(r=0.596，P<0.05)。

2.3ULBP3表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系ULBP3的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。ULBP3表達(dá)在不同性別、腫瘤大小、腫瘤位置、組織學(xué)分級(jí)中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1ULBP3表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系〔n(%)〕

指標(biāo)nULBP3總陽(yáng)性χ2值P值性別 男3427(79.41)1.2100.271 女149(64.29)腫瘤大小(cm) <32622(84.62)2.7970.094 ≥32214(63.64)腫瘤位置 上段1712(70.59)0.2730.601 中下段3124(77.42)臨床分期 Ⅰ、Ⅱ期2515(60.00)6.2610.012 Ⅲ、Ⅳ期2321(91.30)組織學(xué)分級(jí) Ⅰ級(jí)149(64.29)2.0570.358 Ⅱ級(jí)2418(75.00) Ⅲ級(jí)109(90.00)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有2119(90.48)4.7690.029 無(wú)2717(62.96)

3討論

食管癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤，全世界每年約有30萬(wàn)人死于食管癌。我國(guó)是世界上食管癌的高發(fā)地區(qū)之一，病理組織學(xué)類型主要為食管鱗狀細(xì)胞癌〔4〕。NK細(xì)胞自然殺傷功能的發(fā)揮由NK細(xì)胞表面活化性受體和抑制性受體所傳遞的信號(hào)共同決定；NK細(xì)胞表面主要抑制性受體是殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體，其胞質(zhì)區(qū)末端含有免疫受體酪氨酸抑制基序，其配體為組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類分子；NK細(xì)胞表面活化性受體主要分為MHCⅠ類分子特異受體和非MHC Ⅰ類分子特異的受體，包括C型凝集素樣家族成員NKG2D以及自然細(xì)胞毒受體；NKG2D是C型凝集素超家族所屬成員，其配體為MIC A/B和ULBP〔5〕。許多人類上皮源性腫瘤MIC蛋白均呈現(xiàn)高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)NKG2D在該類腫瘤周?chē)?rùn)的淋巴細(xì)胞上也有表達(dá)，NKG2D和其配體交聯(lián)可激發(fā)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，起到腫瘤免疫監(jiān)視中的重要作用〔6〕。NK細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱由靶細(xì)胞表面NKG2D配體和人類白細(xì)胞抗原(HLA)分子的表達(dá)水平共同決定，ULBP3是NKG2D的配體之一，主要表達(dá)于應(yīng)激條件下的腸黏膜上皮細(xì)胞和上皮源性的腫瘤細(xì)胞〔7〕。

本次研究結(jié)果說(shuō)明ULBP3作為一種腫瘤標(biāo)志物可能和食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)，此外，雖然在癌旁組織局部也有少量ULBP3表達(dá)，但和癌組織比較差異顯著，可能是由于炎性浸潤(rùn)導(dǎo)致〔8〕。另外，研究提示在ULBP3可能對(duì)NK細(xì)胞數(shù)量有調(diào)控作用，這和之前的研究結(jié)果相似〔9〕。本研究還提示ULBP3可能參與了食管鱗狀細(xì)胞癌惡性轉(zhuǎn)化、增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移的過(guò)程，這和之前的研究結(jié)果一致〔10〕。

綜上，ULBP3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織的高表達(dá)可能是食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的重要原因，并可能參與了NK細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)，為食管鱗狀細(xì)胞癌的診治和研究提供參考。

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〔2014-02-04修回〕

(編輯袁左鳴)