應(yīng)用熒光原位雜交檢測(cè)初治慢性淋巴細(xì)胞白血病患者的分子遺傳學(xué)異常

劉志何劉春水李薇白晶白鷗

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林長(zhǎng)春130021)

摘要〔〕目的探討熒光原位雜交(FISH)技術(shù)檢測(cè)慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)患者分子遺傳學(xué)異常的臨床意義。方法應(yīng)用FISH技術(shù)，采用4種特異性DNA探針檢測(cè)88例初治CLL患者的分子遺傳學(xué)異常，并結(jié)合患者臨床資料，分析各分子遺傳學(xué)異常與臨床分期的關(guān)系。結(jié)果88例CLL患者中，52例出現(xiàn)分子遺傳學(xué)異常，總異常率為59.1%。RB1基因異常發(fā)生率最高，為30.7%，其后依次為CSP12(27.3%)、P53及ATM缺失發(fā)生率均約為8.0%。結(jié)論FISH技術(shù)檢測(cè)分子遺傳學(xué)異常的敏感性和特異性較高。RB1基因異常是CLL最常見(jiàn)的分子遺傳學(xué)異常。伴P53及ATM基因異常的的CLL分期較晚，預(yù)后較差。

關(guān)鍵詞〔〕慢性淋巴細(xì)胞白血病；分子遺傳學(xué)；熒光原位雜交

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R446.8〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

通訊作者：白鷗(1965-)，女，教授，主要從事淋巴瘤的臨床診斷與治療研究。

第一作者：劉志何(1987-)，男，碩士，主要從事白血病的臨床診斷與治療研究。

慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)以中老年人群為主。CLL患者生存期個(gè)體差異很大。1976年Rai等〔1〕提出的Rai分期系統(tǒng)以及1981年Binet等〔2〕提出的Binet分期系統(tǒng)是目前CLL的經(jīng)典分期系統(tǒng)，但這些分期系統(tǒng)在預(yù)測(cè)分期早或預(yù)后不良患者疾病生物學(xué)行為及預(yù)后方面仍存在不足〔3〕。文獻(xiàn)〔4〕報(bào)道，細(xì)胞遺傳學(xué)異常與CLL患者生物學(xué)行為及預(yù)后密切相關(guān)。但CLL分裂期細(xì)胞比例低，傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)(CC)僅能檢測(cè)出約20%的細(xì)胞遺傳學(xué)異常，而熒光原位雜交(FISH)技術(shù)不僅可檢測(cè)分裂期細(xì)胞，亦可檢測(cè)間期細(xì)胞的分子遺傳學(xué)異常，故在CLL患者中可檢測(cè)出80%以上的分子遺傳學(xué)異常，大大提高了陽(yáng)性率〔5〕。本研究應(yīng)用FISH技術(shù)，采用4種特異性DNA探針檢測(cè)88例初治CLL患者的分子遺傳學(xué)異常，并結(jié)合患者的臨床資料來(lái)探討各種分子遺傳學(xué)異常與疾病分期及預(yù)后的關(guān)系。

1資料與方法

1.1資料2009年7月至2014年7月在我院診斷的門(mén)診和住院CLL患者88例，男49例，女39例，年齡40～84歲，中位年齡61.5歲。所有病例診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》〔6〕。根據(jù)Rain分期，0期10例，Ⅰ期30例，Ⅱ期18例，Ⅲ期15例，Ⅳ期15例。選取我科28例健康骨髓捐獻(xiàn)者的骨髓標(biāo)本為對(duì)照組。

1.2方法

1.2.1骨髓標(biāo)本的預(yù)處理兩組標(biāo)本均取其新鮮骨髓血2 ml，經(jīng)1 400 r/min離心7 min后去掉上清液，然后加盛有預(yù)熱至37℃的0.075 mol/L KCl至8 ml，混勻后37℃溫浴30 min，取出后加1 ml固定液(甲醇：冰乙酸為3∶1)，混勻后1 400 r/min離心7 min，去上清；再加固定液至8 ml，混勻后室溫下靜置30 min，離心，去上清，如此再重復(fù)2次，再加固定液2 ml混勻后用EP管保存?zhèn)溆?。用吸管取EP管里的標(biāo)本滴于干凈的玻片上，自然干燥后將玻片置于56℃的烤片機(jī)上30 min，取出玻片后放入2×SSC、2×SSC溶液中各5 min，取出后將玻片依次置于70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇各2 min脫水。自然干燥玻片。

1.2.2FISH操作步驟①探針：采用4種特異性DNA探針，分別為RB1、ATM、P53、CSP12，分別定為于13q14、11q22.3、17p13.1、12p11.1-12q11.1，以上探針均購(gòu)于北京金蓓嘉生物技術(shù)公司。②標(biāo)本的準(zhǔn)備及變性：用砂輪在玻片背面固定標(biāo)本的對(duì)應(yīng)區(qū)域標(biāo)記出雜交區(qū)域，保證變性溫度達(dá)到78℃，雜交溫度達(dá)到37℃。③探針混合物準(zhǔn)備及變性雜交：室溫下將7 μl雜交緩沖液、1 μl去離子水、2 μl探針加至離心管，離心3～5 s，置于雜交儀中變性5 min(78℃)，雜交16 h(37℃)。④玻片洗滌：將雜交后的玻片取出去掉蓋玻片，放入46℃預(yù)溫的2×SSC溶液中，輕輕晃動(dòng)，洗滌5 min，后放入46℃預(yù)溫的0.1×NP40溶液中，輕輕晃動(dòng)，洗滌3 min，轉(zhuǎn)至室溫，置于70%的乙醇中洗滌2 min，室溫干燥。⑤復(fù)染：加10 μl 4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染劑，加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3熒光顯微鏡檢測(cè)及結(jié)果判讀在熒光顯微鏡選擇符合標(biāo)準(zhǔn)的區(qū)域觀察。在正常間期細(xì)胞中RB1為2個(gè)綠色(2G)，ATM為2個(gè)紅色(2R)，P53為2個(gè)綠色(2G)，CSP12為2個(gè)紅色(2R)；在異常間期細(xì)胞中RB1為1G，ATM為1R，P53為1G，CSP12為3R。

2結(jié)果

2.1對(duì)照組28例對(duì)照組標(biāo)本中每一種探針均觀察300個(gè)間期細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)出異常情況的細(xì)胞比例并建立閾值(閾值=均值+3×標(biāo)準(zhǔn)差)。RB1閾值為4.6%，ATM閾值為5.0%，P53閾值為4.8%，CSP12閾值為3.8%。

2.2病例組

2.2.1FISH檢測(cè)結(jié)果88例初治CLL患者中，無(wú)分子遺傳學(xué)異常36例(40.9%)，59.1%(52/88)的患者至少存在1種以上的分子遺傳學(xué)異常，52例分子遺傳學(xué)異常的患者中，單一分子遺傳學(xué)異常的40例(45.51%)，合并2種分子遺傳學(xué)異常的11例(12.5%)，合并3種分子遺傳學(xué)異常的1例(1.1%)。

最常見(jiàn)的分子遺傳學(xué)異常類(lèi)型為RB1缺失，發(fā)生率為30.7%(27/88)，其次為12號(hào)染色體的增加，發(fā)生率為27.3%(24/88)，發(fā)生率最低的為P53和ATM，均為8.0%(8/88)。

2.2.2分子遺傳學(xué)異常與Rain分期的關(guān)系僅RB1分子遺傳學(xué)異常的患者19例，其中57.9%(11/19)的患者Rain分期為0或Ⅰ期，42.1%(8/19)的患者分期為Ⅱ～Ⅳ期。單獨(dú)12號(hào)染色體異常的CLL患者19例，其中52.6%(10/19)的患者分期為I期，47.4%(9/19)的分期為Ⅱ～Ⅳ期。14例患者P53或ATM單獨(dú)缺失或者合并RB1缺失，85.7%的患者分期為Ⅲ～Ⅳ期。見(jiàn)表1。

表1根據(jù)Rain分期的分子遺傳學(xué)異常〔n(%)〕

Rain分期nATMRB1P53CSP120101(14.3)4(14.8)0(0.0)0(0.0)Ⅰ300(0.0)7(25.9)0(0.0)11(45.8)Ⅱ181(14.3)5(18.5)0(0.0)4(16.7)Ⅲ154(57.2)6(22.2)3(42.9)3(12.5)Ⅳ151(14.3)5(18.5)4(57.1)6(25.0)

3討論

CLL是一種低度惡性的克隆性淋巴細(xì)胞疾病，其生物學(xué)行為存在異質(zhì)性。目前認(rèn)為分子遺傳學(xué)異常與CLL生物學(xué)行為及預(yù)后密切相關(guān)，分子遺傳學(xué)異常主要涉及RB1、ATM、P53、CSP12。相關(guān)資料報(bào)道，僅涉及RB1基因異常的CLL患者中位生存時(shí)間為133個(gè)月，僅涉及12號(hào)染色體基因異常的CLL患者生存期為114個(gè)月，僅涉及ATM基因異常的CLL患者生存期為79個(gè)月，僅涉及P53基因異常的CLL患者生存期為32個(gè)月。

Durak等〔4〕對(duì)79例初治CLL患者進(jìn)行FISH檢測(cè)，其中13q14.3缺失發(fā)生率最高，為32.9%，其后依次為P53缺失(7.6%)、ATM缺失(5.1%)、CSP12(15.2%)；El-Taweel等〔6〕應(yīng)用FISH缺失對(duì)46例初治CLL患者進(jìn)行了檢測(cè)，13q14缺失發(fā)生率最高，為70%，其后依次為P53(24%)、ATM(21.7%)、CSP12(17%)；曹鵬飛等〔7〕應(yīng)用FISH檢測(cè)46例初治CLL患者，分子遺傳學(xué)異常發(fā)生率依次為ATM缺失(17.4%)、13q14.3缺失(30.4%)、P53缺失(15.2%)、CSP12缺失(21.7)、RB1缺失(10.9%)；戴丹等〔8〕應(yīng)用FISH對(duì)30例初治CLL患者進(jìn)行了檢測(cè)，其中發(fā)生率最高的為RB1缺失(43.3%)，其后依次為CSP12缺失(23.3%)、ATM缺失(13.3%)、P53缺失(10.0%)。本研究與戴丹報(bào)道基本一致，而不同于其他文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)。考慮可能與各研究中心所制定的閾值不同有關(guān)。目前國(guó)外將FISH檢測(cè)的閾值定為20%，而國(guó)內(nèi)目前對(duì)于CLL的FISH檢測(cè)尚未制定可參照的標(biāo)準(zhǔn)閾值。

RB1基因?yàn)镃LL患者最常見(jiàn)的分子遺傳學(xué)異常，且在伴IgHV基因突變的CLL患者中更易見(jiàn)，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道〔9〕，伴RB1基因缺失的CLL患者預(yù)后較好。

12號(hào)染色體三體可見(jiàn)于15%～23%的CLL患者〔10〕，既往文獻(xiàn)報(bào)道〔11〕，伴CSP12的CLL患者與高增殖、分期晚及生存期短有關(guān)。但在生存期上優(yōu)于伴有P53或者ATM基因異常的CLL患者，本研究提示預(yù)后一般。

ATM基因位于11q22，該區(qū)域基因異常導(dǎo)致ATM基因成為雜合子〔12〕。ATM基因可傳導(dǎo)DNA損傷信號(hào)及介導(dǎo)P53基因活化，在維持基因穩(wěn)定性方面具有重要作用。P53基因?yàn)橐职┗颍涔δ苷＞哂兄匾呐R床意義，P53基因缺失后導(dǎo)致P53蛋白失去正常功能，而P53蛋白無(wú)功能是疾病進(jìn)展和治療耐藥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

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〔2013-12-09修回〕

(編輯袁左鳴)