糞便中SFRP2基因甲基化與大腸癌的相關性

賈鳳潔孫冬生徐龍健1劉寧曹立贏2

(唐山開灤總醫(yī)院腫瘤科，河北唐山063000)

摘要〔〕目的探討糞便中的分泌型卷曲相關蛋白(SFRP)2基因甲基化對大腸癌患者的診斷價值。方法選取2011年12月至2013年12月該院經病理檢查確診的52例大腸癌病人及32例結腸鏡陰性的健康者(對照組)。通過亞硫酸氫鹽的限制酶法(COBRA)檢測大腸癌52例糞便中SFRP2基因啟動子兩個區(qū)域(區(qū)域1和區(qū)域2)甲基化狀態(tài)，分析SFRP2基因甲基化與腫瘤臨床病理因素的關系。結果大腸癌患者及健康者糞便中廣泛甲基化、部分甲基化及無甲基化分別為59.6%(31/52)、84.6%(44/52)、15.4%(8/52)和12.5%(4/32)，25.0%(8/32)、75.0%(24/32)；廣泛和部分SFRP2的甲基化率在大腸癌患者糞便的檢出率均明顯高于健康體檢者(P<0.05)；SFRP2基因甲基化與大腸癌患者性別、腫瘤分期、浸潤程度無顯著關聯(lián)。結論SFRP2基因甲基化是大腸癌進展過程中的早期事件，糞便SFRP2基因甲基化有望成為早期無創(chuàng)診斷大腸癌的新途徑。

關鍵詞〔〕分泌型卷曲相關蛋白2；基因甲基化；大腸癌

中圖分類號〔〕R735〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：中國煤炭工業(yè)協(xié)會2012年度科學技術研究指導性計劃項目(No.MTKJ 2012-420)

通訊作者：孫冬生(1963-)，男，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤內科方面的研究。

1普外科2肝膽外科

第一作者：賈鳳潔(1972-)，女，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤與基因甲基化關系的方面的研究。

大腸癌的早期診斷有助于提高患者生存率及生活質量，但發(fā)病機制尚不清楚。新進研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學改變和突變在大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，相關基因尤其是抑癌基因、凋亡相關基因、DNA修復基因等啟動子發(fā)生甲基化可導致其表達沉默，并且這是大腸癌發(fā)生的早期事件〔1〕。DNA甲基化改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，正常腸道黏膜每天有大量細胞更新脫落進入腸腔，隨糞便排出體外。分泌型卷曲相關蛋白(SFRP)2基因是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，在大多數(shù)大腸癌中表現(xiàn)出過甲基化。檢測糞便中結直腸相關基因的甲基化狀態(tài)有望成為早期無創(chuàng)診斷大腸癌的新途徑。

1材料與方法

1.1組織及糞便標本的收集 選取2011年12月至2013年12月我院經病理檢查確診的52例大腸癌病人。納入標準〔2〕：(1)首次確診病例；(2)收集標本前未治療和操作性腸道檢查；(3)無其他重要臟器，如心、肺、腎等的病變。排除標準：(1)并發(fā)其他腫瘤；(2)術前均接受化療或放療等治療；(3)不支持或無法配合完成本研究患者。另選取同期32例結腸鏡陰性的健康者為對照組。大腸癌患者男28例，女24例，年齡39～75〔平均(60.4±14.6)〕歲；對照組32例，男17例，女15例，年齡62～68〔平均(65±2.1)〕歲；兩組年齡和性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。所有研究對象的糞便標本均在術前或內鏡檢查前收集，收集后2 h內送至實驗室，分裝后置于-80℃冰箱保存。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2主要儀器德國Analytik JenaAG公司的flexcycler PCR儀；美國Bio-Rad公司 PowerPacTM Basic Power Supply型電泳儀；美國Bio-Rad公司Sub-Cell GT 電泳槽；加拿大carestream公司的Gel Logic 212 PRO型凝膠成像的分析系統(tǒng)；美國Thermo公司Ultro freeze 3410超低溫冰箱；中國寧波永新光學股份有限公司NIB-100型顯微鏡；美國應用生物系統(tǒng)公司(ABI)，310測序儀等。

1.3主要試劑PCR擴增引物中各序列均由上海的英駿公司設計合成；瓊脂糖產于美國的Promega公司；寶生物TEXPAT試劑盒；EZ DNA Methylation KitTM。亞硫酸鹽(Sigma)、苯二酚(Hydroquinone，Sigma)、Buffer(Promega 公司)。

1.4方法

1.4.1糞便DNA提取(不需要精制)取1 mg糞便放入裝有1.5 ml裂解液的2 ml離心管中(裂解液的制作：1 mol/L Tris 5 ml+0.5 mol/L EDTA 1 ml)，95℃加熱10 min后充分震蕩；5 000 r/min離心5 min(室溫)；取上清液放入新的2 ml離心管中。

1.4.2改良的亞硫酸鹽液體配制取1.8 g的亞硫酸鹽(Sigma),放入50 ml離心管中；加入純凈水2 ml、12.5 mol/L的NaOH 100 μl及10 mmol/L 對苯二酚300 μl(Hydroquinone，Sigma)。充分震蕩后微波爐加溫，再次震蕩使之完全溶解。

1.4.3改良的糞便DNA的亞硫酸鹽處理濃度：糞便上清液200 μl + 上述2溶液150 μl(最終亞硫酸鹽濃度2.63 mol/L);溫度條件：95℃ 15 min, 4℃ 10 min,75℃ 60 min。

1.4.4脫硫處理使用EZ DNA MethylationTM Kit。取350 μl的M-Binging Buffer，放入經過上述處理后的溶液中，混勻后放入Zymo-Spin IC Column中500 r/min離心5 min(室溫)；加入M-Desulphonation Buffer 200 μl, 500 r/min離心5 min(室溫)；此操作充分兩次；最后加入純凈水40 μl,室溫放置10 min后離心，作為PCR增擴時DNA模板使用。甲基化引物(熒光標記):SFRP2區(qū)域1正義:GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG，反義：AACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC，熒光標記NED，產物長度139 bp，酶切后長度：139、118、116，Hhal 37℃，12 h；區(qū)域2正義:GGTTGTTAGTTTTTYGGGGTTT，熒光標記 PET；反義:CAACIAACCAAAACCCTACAACAT，產物長度：153 bp，酶切后長度：120 bp，Hhal 37℃，12 h。PCR反應：Hot Start Taq Master Mix 12 μl，上下游引物各0.4 μmol/L，DNA模板4 μl，加水至24 μl。

1.5統(tǒng)計學方法應用SPSS13.0軟件行χ2檢驗。

2結果

2.1經酶切后310測序儀電泳結果經酶切后310測序儀電泳結果見圖1和圖2所示，大腸癌患者糞便SFRP2基因廣泛甲基化，健康人群糞便SFRP2基因無廣泛甲基化。

圖1　大腸癌患者糞便SFRP2基因廣泛甲基化

圖2　健康人群糞便SFRP2基因無廣泛甲基化

2.2兩組研究對象糞便標本甲基化情況比較大腸癌患者及健康者糞便中廣泛甲基化、部分甲基化及無甲基化分別為59.6%(31/52)、84.6%(44/52)、15.4%(8/52)和12.5%(4/32)、25.0%(8/32)、75.0%(24/32)；廣泛和部分SFRP2甲基化在大腸癌患者糞便的檢出率均明顯高于健康體檢者(均P<0.05)。

2.3大腸癌患者臨床特征與重亞硫酸鹽限制性內切酶(COBRA)法檢測糞便SFRP2基因陽性率的關系COBRA檢測糞便結果與大腸癌患者性別、年齡、腫瘤分期等無顯著關聯(lián)(均P>0.05)。見表1。

表1SFRP2基因與大腸癌臨床特征的關系〔n(%)〕

臨床特征nSFRP2基因陽性χ2值P值性別 男2825(89.3)1.0170.313 女2419(79.1)TNM分期 Ⅰ/Ⅱ2521(84.0)0.0140.906 Ⅲ/Ⅳ2723(85.2)浸潤程度 黏膜下層2017(85.0)0.0040.952 >肌層3227(84.4)

3討論

大腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，近年來，隨著經濟的發(fā)展，我國人民生活水平的提高，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，因此大腸癌預防的意義越來越重要〔3〕。由于癌瘤生長速度緩慢，在其達到產生癥狀、體征之前要經過相當長的時間，故臨床前來就診的患者往往癌腫已到晚期〔4〕。因此，早期診斷是提高大腸癌患者生存率及生活質量的關鍵。

DNA的異常甲基化可為非侵襲性檢測結大腸癌提供一種新的策略，通過對無癥狀人群進行篩查或對有大腸癌家族史或確診有癌前病變的患者進行監(jiān)測是發(fā)現(xiàn)早期癌的重要途徑〔5〕。目前傳統(tǒng)確診大腸癌的常規(guī)方法有纖維結腸鏡檢查和病理活檢等，但上述方法要求患者禁食、導瀉等腸道準備，且檢查過程痛苦而繁瑣以及需要花費病人較長的工作及休息時間等因素而不易被患者接受。近年來用于初篩的便潛血試驗因為易受多種因素的影響而出現(xiàn)假陽性和假陰性，特異性差。故尋找更為敏感特異、簡便、無創(chuàng)、安全的檢測手段已成為大腸癌防治的重要課題之一。糞便DNA檢測由于具備上述諸多優(yōu)勢，已成為近年來歐美等國大腸癌檢測研究的熱點〔6〕。最近研究顯示，表觀遺傳學改變特別是DNA甲基化和突變在大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程(結腸息肉、進展型腺瘤和大腸癌)中起著重要的作用，DNA甲基化變化被認為是結直腸癌發(fā)生的一個關鍵機制。人類有五種SFRP基因，其中SFRP2作為Wnt信號調控基因，涉及腫瘤的發(fā)生和進展。據(jù)目前多名學者研究指出SFRP2基因是腫瘤發(fā)生通路——Wnt信號通路的可溶性調整基因之一，在大腸癌、結腸腺瘤和隱窩病灶中發(fā)生頻繁的甲基化，通過基化而使基因沉默的存在是大腸癌一個重要特征〔7〕。據(jù)報道〔8,9〕，正常腸道黏膜每天都會有大量細胞更新脫落進入腸腔，通過糞便排出體外。而大腸癌細胞增殖代謝更較正常腸道黏膜細胞旺盛，只要采取適當?shù)姆椒▽⒓S便中DNA提取出來，經過PCR擴增相關突變基因，再通過適當?shù)姆椒▽U增產物進行分析，糞便中來自胃腸道腫瘤的所有遺傳和后生變化的脫落細胞都能被檢測出來，惡化前的腺瘤和大腸癌都可能通過這種方法檢測,故分析糞便本研究說明糞便中甲基化的SFRP2基因是篩選大腸癌及癌前病變的一個很有前景的敏感的標志。

綜上所述，糞便甲基化檢測有望成為大腸癌早期無創(chuàng)診斷或高風險人群篩選的一個新途徑。

4參考文獻

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9肖著軍,王新穎,李丙生,等.聯(lián)合檢測vimentin和SFRP2甲基化在大腸癌篩查中的應用評價〔J〕.現(xiàn)代消化及介入診療,2014;19(1):13-16,20.

〔2013-12-09修回〕

(編輯袁左鳴)