張興會(huì)，郭 丹，劉 欣，薛 冰，王家明，豆興堂（遼寧省畜牧科學(xué)研究院，遼陽 111000）

電化學(xué)發(fā)光法對(duì)絨山羊孕酮水平檢測(cè)效果分析

張興會(huì)，郭 丹，劉 欣，薛 冰，王家明，豆興堂
（遼寧省畜牧科學(xué)研究院，遼陽 111000）

利用電化學(xué)發(fā)光法跟蹤測(cè)定了絨山羊母羊血清孕酮（P4）水平。結(jié)果表明，在發(fā)情期的0～3 d P4值為（0.68±0.18）ng/mL；之后孕酮水平逐漸上升，于10～12 d間達(dá)到峰值（15.14±3.21）ng/mL，而后開始下降。母羊配種后若妊娠，在推測(cè)下一個(gè)發(fā)情期間，孕酮水平可達(dá)（12.24±3.72）ng/mL以上，妊娠中期也會(huì)保持相對(duì)較高的水平。說明遼寧絨山羊母羊在繁殖季節(jié)體內(nèi)孕酮值隨發(fā)情周期呈規(guī)律性變化。電化學(xué)發(fā)光法與微粒子發(fā)光法測(cè)定孕酮值符合度高。

電化學(xué)發(fā)光法；絨山羊；孕酮

在妊娠早期，母畜外周血漿中的孕酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于發(fā)情期，所以可以通過測(cè)定血液中的孕酮含量來進(jìn)行早期妊娠診斷。傳統(tǒng)的測(cè)定方法主要有放射免疫測(cè)定法（RIA)、酶免疫測(cè)定法（EIA)和乳膠凝集測(cè)定試驗(yàn)（LAIT)，但是這些方法由于操作比較復(fù)雜，試劑效果不穩(wěn)定，所以并未得到廣泛應(yīng)用。本課題組于2003年使用EIA法開展了絨山羊早期妊娠診斷研究，利用酶標(biāo)儀分三批板（48孔、48孔、96孔)測(cè)定母羊血清孕酮水平，共計(jì)樣本164個(gè)，包括重復(fù)樣18對(duì)，檢測(cè)結(jié)果變異幅度較大，無規(guī)律可循。經(jīng)查詢，電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)（ECLI）具有敏感度高、線性范圍大、測(cè)定時(shí)間短及試劑穩(wěn)定性長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究采用ECLI法測(cè)定遼寧絨山羊血清孕酮，現(xiàn)將試驗(yàn)過程報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在遼寧絨山羊科技示范場(chǎng)，于2014年春季和秋季利用公羊試情，在一個(gè)月內(nèi)共選取發(fā)情母羊13只，篩選要求為健康、無繁殖疾病的經(jīng)產(chǎn)母羊，其中6只本交配種，并定期跟蹤測(cè)定13只羊的孕酮（P4）水平。

1.2 儀器與試劑

肝素鈉抗凝劑：購(gòu)自上海阿敏生物技術(shù)有限公司；低溫離心機(jī)：Centrifuge5417R，Eppendor；放射免疫測(cè)定儀：國(guó)產(chǎn)Gc-1200型；全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特UniCelDxI800；干燥箱：上海大東試驗(yàn)設(shè)備有限公司；-20℃冰箱：河南新飛電器有限公司；電子天平：MPZO02，上海橫平科學(xué)儀器有限公司；可調(diào)式微量移液器：Eppendorf公司；壓力蒸汽滅菌鍋：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗凝管的制備 將2mL的離心管洗凈烘干后，經(jīng)高壓滅菌，浸泡于1∶500比例配制好的肝素鈉溶液中，10 min后烘干備用。

1.3.2 試驗(yàn)羊的采血及處理 應(yīng)用一次性注射器從頸靜脈采集試驗(yàn)羊的外周血液：固定母羊頸部，在頸中1/3處找到頸靜脈溝，左拇指施壓，使靜脈血回流受阻而膨脹，確定血管隆起最高部位，延頸靜脈縱向與頸呈45°角，將針頭刺入血管內(nèi)采血3～4mL。將采到的血液裝入抗凝管，并做好記錄。將采集的血樣以3 000 r/min離心15min后分離血漿，-69℃凍存以備測(cè)定激素。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定 用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記P4，與待測(cè)樣本中相應(yīng)的P4反應(yīng)，通過磁場(chǎng)把結(jié)合狀態(tài)（沉淀部分)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物分離開來，然后加入發(fā)光促進(jìn)劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，通過對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的檢測(cè)進(jìn)行定量及定性檢測(cè)。

1.3.3.1 電化學(xué)反應(yīng)過程 在工作電極陽極加一定的電壓能量作用下，二價(jià)的三氯聯(lián)吡啶釕［Rubpy3］2+釋放電子發(fā)生氧化反應(yīng)而成為三價(jià)的三氯聯(lián)吡啶釕［Rubpy3］3+，同時(shí)，電極表面的TPA也釋放電子發(fā)生氧化反應(yīng)而成為陽離子自由基TPA+，并迅速自發(fā)脫去一個(gè)質(zhì)子而形成三丙胺自由基TPA。

1.3.3.2 化學(xué)發(fā)光過程 具有強(qiáng)氧化性的［Rubpy3］3+和具有強(qiáng)還原性的三丙胺自由基TPA發(fā)生氧化還原反應(yīng)，結(jié)果使三價(jià)的三氯聯(lián)吡啶釕［Rubpy3］3+還原成激發(fā)態(tài)的二價(jià)三氯聯(lián)吡啶釕［Rubpy3］2+，其能量來源于［Rubpy3］3+與三丙胺自由基TPA之間的電勢(shì)差，激發(fā)態(tài)［Rubpy3］2+以熒光機(jī)制衰變并以釋放出一個(gè)波長(zhǎng)為620 nm光子的方式釋放能量，而成為基態(tài)的［Rubpy3］2+。

1.3.3.3 循環(huán)過程 上述化學(xué)發(fā)光過程后，反應(yīng)體系中仍存在二價(jià)的三氯聯(lián)吡啶釕［Rubpy3］2+和三丙胺TPA，使得電極表面的電化學(xué)反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光過程可以繼續(xù)進(jìn)行，這樣整個(gè)反應(yīng)過程可以循環(huán)進(jìn)行。

1.3.3.4 測(cè)定 通過上述的循環(huán)過程，測(cè)定信號(hào)不斷放大，分離后，檢測(cè)體系中剩余二價(jià)的三氯聯(lián)吡啶釕［Rubpy3］2+經(jīng)上述過程后所發(fā)出的光，即可得知P4的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)為定期跟測(cè)處于發(fā)情周期天數(shù)相同的母羊，而母羊均為自然發(fā)情，發(fā)情日期并不在同一天，而采血日期相對(duì)固定，因此采樣時(shí)母羊所處發(fā)情或配種后天數(shù)是不同的，孕酮值為發(fā)情后一定區(qū)間范圍內(nèi)的統(tǒng)計(jì)值。由表1可看出，母羊8～17 d血清的P4水平極顯著高于發(fā)情0～3 d水平（P＜0.01），10～12 d達(dá)到周期中的峰值，顯著高于16～17 d的P4值。抽測(cè)配種21 d后的血清孕酮值顯示，孕酮水平與發(fā)情周期的峰值差異不顯著（12.24 ng/mL±3.72 ng/mL VS 15.14 ng/mL±3.12 ng/mL，P＞0.05），且血清孕酮值具有隨著母羊妊娠天數(shù)增加而升高的趨勢(shì)。

表1 絨山羊孕酮水平檢測(cè)結(jié)果ng/mL

3 討論與小結(jié)

許欣等［1］對(duì)85只配種后21 d左右未出現(xiàn)返情的湖羊采用放射免疫測(cè)定法（RIA)測(cè)定其外周血中的孕酮水平，結(jié)果表明，妊娠羊的孕酮含量為（2.33±0.70）ng/mL，未妊娠羊?yàn)椋?.24±0.33）ng/mL。李愛華等［2］利用孕酮（P4）試劑盒對(duì)寧夏地區(qū)的舍飼灘母羊的測(cè)定結(jié)果顯示：孕酮含量從泌乳期、空懷期、發(fā)情期、妊娠前期和妊娠后期呈遞增的趨勢(shì)，分別為0.05、0.05、0.14、0.17、0.50 ng/mL。而本研究中妊娠羊孕酮含量最低，為（12.24±3.72）ng/mL，且隨著妊娠期的延長(zhǎng)有上升之勢(shì)。趙偉等［3］用微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)測(cè)定了波爾山羊孕酮濃度的變化。結(jié)果顯示：發(fā)情開始孕酮濃度（1.5±0.23）ng/mL，第7天開始明顯升高，達(dá)（3.5±0.23）ng/mL，第11天最高，達(dá)（8.3±0.23）ng/mL，以后逐漸下降。在妊娠期的最初15 d，激素的變化與發(fā)情周期相類似，但第20天后孕酮明顯升高，達(dá)（12.7±3.3）ng/mL，以后至分娩前維持在較高水平。這與本試驗(yàn)采用電化學(xué)發(fā)光法所得檢測(cè)結(jié)果較為相似。

從本測(cè)定記錄來看，母羊配種后，在推算到下一個(gè)發(fā)情周期時(shí)，妊娠羊孕酮檢測(cè)值（個(gè)體測(cè)定數(shù)據(jù)）最低為8.24 ng/mL，最高為18.34 ng/mL，且妊娠中期也會(huì)保持相對(duì)恒定的水平。這與羊處于發(fā)情前后生殖激素的變化規(guī)律相符，即周期性黃體溶解后，血清中孕酮水平降至最低，誘發(fā)發(fā)情與排卵。

本研究可為絨山羊早期妊娠診斷提供測(cè)定依據(jù)。配種后是否返情是多年來判斷受胎與否的主要方法，因隱性發(fā)情羊在試情過程中無法挑出，會(huì)有部分羊只漏配。而目前，舍飼羊隱性發(fā)情現(xiàn)象有增多趨勢(shì)，為盡早補(bǔ)配，可在推斷配種后的下一個(gè)發(fā)情期階段進(jìn)行孕酮檢測(cè)，來確定是否妊娠。

［1］ 許欣.湖羊早期妊娠診斷免疫膠體金層析試紙條的初步研制［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［2］ 李愛華，李耀忠，楊鳳寶，等.舍飼灘母羊生殖激素變化規(guī)律的初探［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2009，30（5）：54-55.

［3］ 趙偉，王公金，徐曉波.波爾山羊發(fā)情周期和妊娠期外周血漿中孕酮、雌二醇和睪酮的濃度變化［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（3）：60-63.

S827.3

A

2095-3887（2015）04-0027-02

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.04.008

2015-05-15

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013020068）、（201202110）

張興會(huì)（1972-），男，高級(jí)畜牧師，碩士，主要從事動(dòng)物繁殖與胚胎生物工程技術(shù)研究。