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黃板樹根提取液對白細(xì)胞介素-18在骨性關(guān)節(jié)炎滑液中的表達(dá)影響及意義*

王鳳龍1肖智青1朱錦忠1王愛明1徐洲發(fā)1張火林1江建明2

（1廣東省河源市中醫(yī)院河源517000；2南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院廣東廣州517515）

摘要：目的：了解使用黃板樹根提取液外用熏洗對骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者白細(xì)胞介素-18（Interleukin 18，IL-18）在滑液中表達(dá)的影響及意義。方法：觀察正常膝關(guān)節(jié)滑膜組織與OA病變滑膜組織在組織形態(tài)及病理切片的差異，對OA患者（n=30）使用黃板樹根提取液熏洗治療，分別提取治療前后的關(guān)節(jié)滑液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）定量檢測熏洗治療前后關(guān)節(jié)滑液中IL-18蛋白的表達(dá)水平，并比較其表達(dá)的差異。結(jié)果：正?；そM織肉眼觀為淡紅色或瓷白色，OA滑膜組織多為粉紅色；病理切片顯示：相比正?；そM織，OA滑膜組織出現(xiàn)明顯的血管增生和炎細(xì)胞浸潤，符合組織慢性炎癥病變特征；ELISA檢測治療前OA患者滑液中IL-18的表達(dá)含量為（52.625±11.336）pg/ml，治療后OA患者滑液中IL-18的表達(dá)含量為（22.512±2.021）pg/ml，兩者之間具備統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)論：黃板樹根提取液熏洗治療可以使OA關(guān)節(jié)滑液中炎性因子IL-18表達(dá)水平下降，提示黃板樹根提取液可能對OA有一定的治療作用。

關(guān)鍵詞：骨性關(guān)節(jié)炎；黃板樹根提取液；白細(xì)胞介素-18；滑液

廣東省河源市社會發(fā)展科技計劃項目（編號：2013054）

在中老年人發(fā)病排行上，骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）僅次于心腦血管疾病，排于第二位，它是一種十分常見的老年骨關(guān)節(jié)退行性病變[1]。它的發(fā)病機(jī)制主要是由于抗炎因子與促炎因子失衡，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞和滑膜炎癥反應(yīng)。隨著社會生活節(jié)奏的不斷加快以及人口老齡化的迅速發(fā)展,各種因素造成的骨關(guān)節(jié)損傷和退變已經(jīng)成為骨科醫(yī)師面臨的最普遍、最嚴(yán)峻的問題。從病因?qū)W方面來講，骨性關(guān)節(jié)炎主要表現(xiàn)在兩大方面：一是各種原因造成的軟骨細(xì)胞性狀改變，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生破壞；二是滑膜組織發(fā)生炎癥反應(yīng)致使滑膜細(xì)胞受到炎性刺激，繼而釋放大量的炎癥介質(zhì)。通過既往研究發(fā)現(xiàn)，滑膜細(xì)胞可以釋放的炎性介質(zhì)有多種，白細(xì)胞介素-18（IL-18）是近年來人們通過研究發(fā)現(xiàn)的一種新的致炎細(xì)胞因子[2]，它的生物學(xué)功能主要為介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)，并且與一些自身免疫性疾病有關(guān)聯(lián)。多年來，醫(yī)學(xué)研究工作者都在不斷探索尋找一種積極而有效的治療OA的方法，西醫(yī)治療從早期的口服藥物治療和關(guān)節(jié)腔注射，到中期的關(guān)節(jié)鏡治療，以至于終末期的人工關(guān)節(jié)置換術(shù)。雖然在關(guān)節(jié)疾病發(fā)生發(fā)展的某一過程中上述治療都起到了一定的效果，但同時漫長的病程及高額的醫(yī)療費(fèi)用也給患者及家屬帶來沉重的心理壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。所以，尋找一種廉價、方便、且有效的骨性關(guān)節(jié)炎治療方法，成為醫(yī)學(xué)界的共識[3]。

中醫(yī)學(xué)按辨證論治將骨性關(guān)節(jié)炎分為三種證型：風(fēng)寒濕痹證、瘀血痹阻證和肝腎不足證。中醫(yī)認(rèn)為，本病的發(fā)生以腎精虧虛為本，還與外邪侵襲、勞損過度、外傷等有關(guān)。本病基本病因病機(jī)為虛、瘀、濕、熱，而精血虧虛、肝腎陰虛是發(fā)病的關(guān)鍵。病位在筋骨，與肝、腎密切相關(guān)。病性多為本虛標(biāo)實，發(fā)作期以標(biāo)實為主，緩解期以本虛為主。相對于西醫(yī)不同階段對癥施治來講，中醫(yī)藥[4~5]一般多采用綜合治療的方法來對骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)行辨證施治，主要包括全身中成藥物治療為主，局部手法按摩、針灸、熏藥及功能鍛煉等為輔的多方法綜合治療體系，具有自己獨(dú)特的治療優(yōu)勢。本院以往采用黃板樹根提取液治療慢性骨髓炎患者取得滿意療效，因黃板樹根為獨(dú)味中藥，費(fèi)用低廉，且其作用機(jī)制鮮見報道。故本研究旨在通過對骨性關(guān)節(jié)炎患者使用黃板樹根提取液熏洗治療，并分別提取治療前后關(guān)節(jié)滑液，用ELISA法定量檢測治療前后滑液中炎性因子IL-18蛋白的表達(dá)水平，并比較其表達(dá)是否存在差異，明確黃板樹根提取液在OA中的作用及意義，為OA患者提供一種“簡、便、廉、驗”的臨床治療方法。

1　對象與方法

1.1研究對象OA滑膜標(biāo)本主要取自南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院脊柱骨病科收治的髖膝關(guān)節(jié)OA行關(guān)節(jié)置換術(shù)患者，患者診斷均采用美國風(fēng)濕病學(xué)會（ARA）2001年診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除其它疾病所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)炎。正常關(guān)節(jié)滑膜標(biāo)本取自創(chuàng)傷后截肢病人，所有取材均排除OA病史，術(shù)前均已告知患者，并取得患者知情同意；同時收集2013年6月~2014年12月在河源市中醫(yī)院骨傷科因膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)行保守治療的患者30例，其中男17例，女13例，年齡41~85歲，平均（60.2±11.3）歲，分別抽取其治療前后的關(guān)節(jié)滑液。所有OA患者診斷標(biāo)準(zhǔn)采用美國風(fēng)濕病學(xué)會于2001年提出的膝OA診斷標(biāo)準(zhǔn)，具體如下：臨床診斷+放射學(xué)標(biāo)準(zhǔn)：（1）前月大多數(shù)時間有膝痛；（2）骨贅形成；（3）年齡＜40歲；（4）晨僵時間＜30 min；（5）有骨摩擦音。滿足（1）+（2）條或（1）+（3）+（5）條，或（1）+（4）+（5）條者作為膝骨關(guān)節(jié)炎診斷，本研究得到所有對象的知情同意。

1.2主要試劑及器材黃板樹根提取液，EP管，離心管，倒置相差顯微鏡（Olympus），超凈工作臺，組織切片設(shè)備，人白細(xì)胞介素-18，ELISA Kit（Uscnlife Science & Technology Company，武漢中美科技有限公司進(jìn)口組裝）。

1.3滑膜組織病理切片及HE染色

1.3.1組織病理切片法（1）取材：分別取OA滑膜組織及正常滑膜組織，組織塊大小為2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm；（2）組織固定：新鮮取材后，即刻以10%甲醛固定液固定組織塊12 h；（3）脫水透明：脫水步驟：80%、90%、95%、100%乙醇各2 h；透明步驟：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各1.5 h；（4）浸蠟、包埋、切片。

1.3.2 HE染色法（1）貼片與烤片；（2）切片在二甲苯中脫蠟5~10 min；（3）移入二甲苯和純酒精（1∶1）混合液中5 min左右；（4）入100%、95%、85%、70%乙醇，各級為2~5 min，最后經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入染液；（5）蘇木精染液染色5~15 min；（6）水洗玻片上多余染液，0.5%~1%鹽酸酒精（70%酒精配制）分色片刻。鏡檢控制，直至細(xì)胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止，約數(shù)10 s；（7）流水沖洗15~30 min，或者在碳酸鋰飽和液中短時間堿化或藍(lán)化，即細(xì)胞核呈藍(lán)色；（8）蒸餾水短洗；（9）0.1%~0.5%伊紅染液染色1~5 min；（10）依次經(jīng)70%、85%、95%、100%乙醇脫水各2~3 min；（11）二甲苯透明（2次），共約10 min；（12）封片及鏡檢：擦去切片周圍多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加適量中性樹膠，再加蓋玻片封固，在光鏡下做病理學(xué)觀察。

1.4關(guān)節(jié)滑液中上清液收集對OA患者治療前抽取關(guān)節(jié)滑液3 ml，分別編號，并置于-20℃冰箱中備用；對OA患者經(jīng)黃板樹根提取液熏洗1個療程（7 d）后，再分別抽取其關(guān)節(jié)滑液3 ml，對應(yīng)編號，并置于-20℃冰箱中備用；

1.5酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測將-20℃保存的關(guān)節(jié)滑液放于冰盒完全解凍后，按ELISA檢測試劑盒說明操作：加樣，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100 μl，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)120 min，棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100 μl，37℃，60 min。洗板3次，350 μl/每孔，甩干。每孔加檢測溶液B工作液100 μl，37℃，60 min洗板5次，甩干。依序每孔加底物溶液90 μl，37℃避光顯色30 min（此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3~4孔有明顯的梯度蘭色，后3~4孔梯度不明顯）。依序每孔加終止溶液50 μl，終止反應(yīng)（此時蘭色立轉(zhuǎn)黃色）。用酶聯(lián)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，對黃板樹根提取液治療前后OA患者關(guān)節(jié)滑液中IL-18含量進(jìn)行比較，采用方差不齊的t檢驗進(jìn)行分析，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P＜0.05為有顯著性差異。

2　結(jié)果

2.1滑膜組織形態(tài)及病理切片觀察收取的OA滑膜組織與正?；そM織在外觀上差異不大，肉眼觀正?；そM織為瓷白色或淡粉色（圖1），而OA滑膜組織多為粉紅色（圖2）。病理切片HE染色顯示：相比正?；そM織（圖3），OA滑膜組織出現(xiàn)明顯的血管擴(kuò)張和炎細(xì)胞浸潤（圖4箭頭所示），符合慢性炎癥表現(xiàn)。

2.2 ELISA法檢測關(guān)節(jié)滑液中IL-18含量根據(jù)酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），以及IL-18標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5），計算待測標(biāo)本濃度。對OA患者黃板樹根提取液治療前后關(guān)節(jié)滑液IL-18含量進(jìn)行檢測后進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，t=8.052，P＜0.001，治療前后IL-18含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

3　討論

骨性關(guān)節(jié)炎是中老年人中最常見的疾病。目前據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，OA的發(fā)病人口已占世界人口總數(shù)的10%左右，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為OA的發(fā)病是多因素的，雖然對于骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理已有大量的研究報道，但目前學(xué)術(shù)界仍未有一個明確的共識；骨性關(guān)節(jié)炎的典型特征為骨贅的形成和軟骨下骨的硬化[6]。雖然骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病也有一些易感因素，例如性別、肥胖，但是骨性關(guān)節(jié)炎最主要的易感因素是年齡[7]，Murphy等[8]研究顯示接近50%的成年人在85歲之前發(fā)展成有癥狀的骨性關(guān)節(jié)炎，這主要是隨著年齡逐漸增加，對關(guān)節(jié)軟骨有保護(hù)作用的蛋白多糖會逐漸減少，膠原纖維和糖化作用終末產(chǎn)物的交聯(lián)顯著增加，使這種老化軟骨變成更脆弱和易受損傷而關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)受破壞[9~10]，但這些都是骨性關(guān)節(jié)炎病變的終末期表現(xiàn)，要想真正延緩和控制骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病，還要從關(guān)節(jié)早期的微小病變研究做起。從目前對于骨性關(guān)節(jié)炎的研究情況表明，大多數(shù)學(xué)者在骨性關(guān)節(jié)炎早期的病變過程中均涉及滑膜炎這一病理改變，滑膜發(fā)生炎癥使其產(chǎn)生的滑液中釋放大量的細(xì)胞因子，其中部分細(xì)胞因子均有誘導(dǎo)炎癥發(fā)生發(fā)展的作用，目前研究較多的細(xì)胞因子主要有：IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子、一氧化氮及前列腺素E2等，它們主要是通過直接起效、與其他炎性因子結(jié)合或通過其分解轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物發(fā)生炎性作用。

本研究先從收集的滑膜組織肉眼形態(tài)觀察及鏡下病理切片觀察兩個方面進(jìn)行研究對比，收取的OA滑膜組織與正?；そM織在外觀上差異不大，肉眼觀正常滑膜組織為瓷白色或淡粉色，而OA滑膜組織多為粉紅色，病理組織切片HE染色顯示相比正?；そM織，OA滑膜組織中出現(xiàn)明顯的血管擴(kuò)張和炎細(xì)胞浸潤，完全符合慢性炎癥的表現(xiàn)，OA滑膜組織肉眼觀察色澤較正?；そM織深，可能與其炎癥反應(yīng)血管擴(kuò)張及充血水腫有一定關(guān)系，這也在一定程度上證明了在OA滑膜組織中炎癥反應(yīng)及炎性介質(zhì)的參與。

IL-18是近年來研究學(xué)者新發(fā)現(xiàn)且越來越被重視的一種致炎因子，它具有多種生物學(xué)功能參與多種炎癥反應(yīng)過程，且在不同的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。IL-18最初是由國外研究學(xué)者從注射脂多糖的小鼠肝臟及熱滅活丙酸桿菌中提取一種能誘導(dǎo)Th1產(chǎn)生干擾素-γ的細(xì)胞因子[11]，它在結(jié)構(gòu)上與IL-1相類似，但在功能上又與IL-12大近相同。目前有研究表明IL-18隸屬于IL-1家族，因為其在發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)時的受體和轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與IL-1完全相同。有研究表明：在發(fā)揮炎癥效應(yīng)方面，IL-18一方面可以通過協(xié)同IL-12一起發(fā)揮作用，然后誘導(dǎo)

表1　治療前后IL-18含量比較（pg/ml，x±s）

圖1　正?；そM織外觀像

圖2　OA滑膜組織外觀像

圖3　正?；そM織病理切片圖HE染色（×400）

圖4　OA滑膜組織病理切片圖HE染色（×400）

圖5　IL-18在關(guān)節(jié)滑液中的表達(dá)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

TNF-α的表達(dá)，而TNF-α已被研究證實對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和滑膜組織的增生發(fā)揮促進(jìn)作用；另一方面，IL-18可以對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞COX-2、iNOS等基因的表達(dá)產(chǎn)生直接刺激作用，從而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，如PGE2、NO等，從而參與關(guān)節(jié)的炎癥、損傷及退行性變等過程[12]。此外，在對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究過程中發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液和血清中IL-18表達(dá)水平較其他組織明顯增高，且在治療過程中通過試驗性使用IL-18結(jié)合蛋白及IL-18單克隆抗體進(jìn)行治療，炎癥的發(fā)展可被明顯控制，上述研究表明IL-18可作為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床療效和預(yù)后判斷的一個重要指標(biāo)。有研究表明，在局部滑膜炎癥中IL-18表達(dá)能明顯提高和擴(kuò)增TNF-α及IL-1β的表達(dá)水平，且在疾病的不同階段這種擴(kuò)增效應(yīng)不同，在炎癥急性期這種效應(yīng)尤為明顯，這表明IL-18可能是骨關(guān)節(jié)炎起病及發(fā)生過程中最初的、主要的一種細(xì)胞因子[13~14]。

中醫(yī)中藥防治骨關(guān)節(jié)炎具有悠久歷史，并且其具有獨(dú)特的療效。膝骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“痹證”范疇，基本病機(jī)特點(diǎn)為“本虛標(biāo)實、虛實夾雜”，《素問·痹論》“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”，感受風(fēng)、寒、濕、之邪，使氣血運(yùn)行不暢，經(jīng)絡(luò)痹阻，而形成痹證。黃板樹根是在吸收河源民間療法的基礎(chǔ)上發(fā)掘的單方驗方，該藥性平，味甘微澀，長期臨床實踐和民間考察發(fā)現(xiàn)該藥具有活血止痛、祛風(fēng)濕通經(jīng)絡(luò)、清熱解毒等作用，《內(nèi)經(jīng)》中記載：“其有邪者，漬形以為汗”，故選用熏洗療法，局部吸收，直達(dá)病所，達(dá)到祛風(fēng)除濕、活血止痛之效，能擴(kuò)張血管，促進(jìn)患處局部的血液循環(huán)，有利于炎癥介質(zhì)吸收，以緩解疼痛，滑利關(guān)節(jié)，從而達(dá)到改善關(guān)節(jié)功能的作用[15]。因黃板樹根取自民間經(jīng)驗方，目前對其研究報道僅見于其治療慢性骨髓炎的實驗研究[16]，對于其在骨性關(guān)節(jié)炎中所起的生物學(xué)機(jī)理有待課題組進(jìn)一步研究。

本研究通過對OA患者使用黃板樹根提取液熏洗治療，并比較治療前后關(guān)節(jié)滑液中IL-18的表達(dá)水平，統(tǒng)計學(xué)顯示黃板樹根熏洗治療前后關(guān)節(jié)滑液中IL-18表達(dá)含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這也從一方面證實了黃板樹根提取液熏洗治療后可以使OA關(guān)節(jié)滑液中炎性因子IL-18表達(dá)下調(diào)，能更直接地反映出黃板樹根提取液對于OA病變過程中炎性因子IL-18的表達(dá)有一定的干預(yù)控制作用，從而達(dá)到治療骨關(guān)節(jié)炎的作用。本研究期間未發(fā)生并發(fā)癥，說明黃板樹根提取液熏洗治療安全性高，價格低廉，效果確切，操作簡單，易于推廣。但因骨關(guān)節(jié)炎病理機(jī)制復(fù)雜，因此對黃板樹根提取液抑制IL-18表達(dá)治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制需做更進(jìn)一步的研究，從而明確黃板樹根提取液消炎止痛的作用機(jī)制，為臨床治療OA提供更多理論依據(jù)。

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The Expression and Significance of Huangban Tree Extract for IL-18 in Synovial Fluid of Patients with Osteoarthritis

WANG Feng-long1, XIAO Zhi-qing1, ZHU Jin-zhong1, WANG Ai-ming1, XU Zhou-fa1, ZHANG Huo-lin1, JIANG Jian-ming2

(1Heyuan hospital of Traditional Chinese Medicine of Guangdong Province, Heyuan517000;

2South Medical University Affiliated Nanfang Hospital, Guangzhou510515)

Abstract:Objective: To explore the expression and significance of Huangban tree extract for IL-18 in synovial fluid of patients with osteoarthritis (OA). Methods: Observed the open and pathological difference between normal synovium and OA synovium. Gathered the primary synovial fluid from OA patients (n=30), and then treated those patients with Huangban tree extract, taken the synovial fluid again after treatment, The concentrations of IL-18 were measured in human OA synovial fluid by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), compared the difference. Results: The normal synovium was light red or white porcelain, while the OA synovium was pink. The pathological section of synovium showed: compared to normal synovium, the OA synovium had evident hyperplasy in vessel and infiltrating by inflammatory factors. This was the character of chronic inflammation. The average value of IL-18 in OA before treatment was (52.625±11.336) pg/ml. The average value after treatment was (22.512±2.021) pg/ml. There was a significant statistics difference between them (P＜0.05). Conclusion: After the treatment of Huangban tree extract IL-18 is lower expressed in synovial fluid of OA patients, it may play an important role in the treatment of OA.

Key words:Osteoarthritis; Huangban tree extract; Interleukin 18; Synovial fluid

收稿日期：（2015-04-13）

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2015.09.001

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

中圖分類號：R684.3

*基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：30571890）