孫曉飛，宋大賀，劉淑艷，萬 超，孫 燕（.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 6000；.大連機(jī)場出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 6000; .大連森林動物園，遼寧 大連 6000）

甲醇對HepG-2細(xì)胞毒理作用的初步研究

孫曉飛1，宋大賀2，劉淑艷1，萬 超1，孫 燕3
（1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116000；2.大連機(jī)場出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116000; 3.大連森林動物園，遼寧 大連 116000）

以HepG-2細(xì)胞作為研究對象，不同濃度甲醇作用細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，采用CCK-8法測定吸光度值，確定甲醇對細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇濃度達(dá)到8%時，對細(xì)胞毒力作用顯著，所以，在使用甲醇作為貝類毒素的溶劑時，甲醇的使用濃度要＜8%。

甲醇；HepG-2細(xì)胞；細(xì)胞活力

本次研究將甲醇配制為不同濃度的儲備液，作用細(xì)胞中，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。采用CCK-8檢測試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，確定甲醇對細(xì)胞的影響。

1 材料和試劑

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株 HepG-2人類肝腫瘤細(xì)胞株，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

1.1.2 儀器

酶標(biāo)儀；

培養(yǎng)搖床：SHKE4000-1CE；

二氧化碳培養(yǎng)箱：NU-5510E；

一次性移液器：corning 10 mL；

移液器：Eppendorf10 mL；

多通道移液器：0～200 μm；

細(xì)胞培養(yǎng)板：96孔；

濾膜：0.22 μm；

1.1.3 試劑

CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒；

甲醇（分析純）；

細(xì)胞培養(yǎng)液：High-DMEM培養(yǎng)基；

胎牛血清：Gibco；

細(xì)胞消化液：胰酶-EDTA；

PBS磷酸鹽緩沖液。

1.2 試劑配制細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM高糖培養(yǎng)基中加入12%胎牛血清，1‰青霉素和鏈霉素

甲醇儲備液：用無血清培養(yǎng)基配制不同濃度甲醇溶液，體積分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，11%、12%，0.22 μm過濾，4℃保存。

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理將對數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化，將細(xì)胞反復(fù)吹打呈單個個體，用完全培養(yǎng)液重懸，測定細(xì)胞濃度。用多通道移液器將細(xì)胞懸液移入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接入100 μL（四周培養(yǎng)孔內(nèi)不加入細(xì)胞懸液，加入100 μL無血清培養(yǎng)基，作為空白對照）37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h[4]。

吸棄96孔板內(nèi)舊培養(yǎng)液，分別加入100 μL不同濃度的甲醇儲備液，每個劑量3個重復(fù)孔，同時設(shè)空白、對照組。37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別在6、12、24、48 h對細(xì)胞進(jìn)行觀察，比較細(xì)胞形態(tài)的變化。

表1 不同濃度甲醇的配制Table1 Different concentrations of methanol

2.2 甲醇對細(xì)胞活力的測定本次檢測試劑盒采用CCK-8細(xì)胞增殖-細(xì)胞毒性檢測試劑盒，主要原理是CCK-8內(nèi)的本四唑鹽在電子載體存在的情況下能夠被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原成橙黃色的水溶性的Fomazan，生成的Fomazan量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)量呈線性關(guān)系。

甲醇作用細(xì)胞24 h后，棄掉原培養(yǎng)液，更換新無血清培養(yǎng)基。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育4 h，450 nm條件下測定各孔吸光值，計(jì)算細(xì)胞活力。

A試驗(yàn)：具有細(xì)胞、藥物溶液和CCK-8溶液的孔的吸光度值；

A空白：含有細(xì)胞培養(yǎng)基和CCK-8溶液，不含細(xì)胞的孔的吸光度值；

A對照：具有細(xì)胞和CCK-8溶液，不含藥物溶液的孔的吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 甲醇對細(xì)胞形態(tài)影響通過在不同時間點(diǎn)對細(xì)胞形態(tài)的觀察比較，確定甲醇作用細(xì)胞24 h時為最佳測定時間。甲醇對HepG-2人肝癌細(xì)胞染毒24 h后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，如圖1～10所示。圖1中對照組細(xì)胞呈梭形生長，且細(xì)胞之間緊密連接；試驗(yàn)組低濃度甲醇對細(xì)胞未有明顯作用，當(dāng)甲醇濃度達(dá)到6%時，有死細(xì)胞出現(xiàn)，但數(shù)量極少；當(dāng)甲醇濃度達(dá)到8時，30%細(xì)胞變圓縮小，對細(xì)胞呈現(xiàn)毒理作用；且隨著甲醇濃度的增加，變化越趨明顯，9%的甲醇致細(xì)胞50%～60%變圓縮小，部分細(xì)胞脫壁，細(xì)胞周圍出現(xiàn)透明圈。10%的甲醇組細(xì)胞幾乎全部呈圓形，部分細(xì)胞出現(xiàn)彌散狀等細(xì)胞凋亡特征；當(dāng)甲醇濃度達(dá)到12%時，100%細(xì)胞彌散狀態(tài)。

圖1 對照組Fig.1 Control group

圖2 1%甲醇添加組對細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.2 1%methanoladditiongrouptoobservethecellmorphology

圖3 2%甲醇添加組對細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.3 2%methanol addition group to observe the cell morphology

圖4 3%甲醇添加組對細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.4 3%methanol addition group to observe the cell morphology

圖5 4%甲醇添加組對細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.5 4%methanol addition group to observe the cell morphology

圖6 5%甲醇添加組對細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.6 5%methanoladditiongrouptoobservethecellmorphology

圖7 6%甲醇添加組對細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.7 6%methanol addition group to observe the cell morphology

圖8 7%甲醇添加組對細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.8 7%methanol addition group to observe the cell morphology

圖9 8%甲醇添加組對細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.9 8%methanol addition group to observe the cell morphology

圖10 10%甲醇添加組對細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.10 10%methanol addition group to observe the cell morphology

圖11 12%甲醇添加組對細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.11 12%methanol addition group to observe the cell morphology

3.2 CCCCKK-- 88檢測試劑盒試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)數(shù)據(jù)按公式①計(jì)算細(xì)胞存活率，將存活率轉(zhuǎn)換成增殖抑制率，以甲醇試驗(yàn)組為橫坐標(biāo)，不同濃度甲醇對HepG2細(xì)胞染毒的細(xì)胞增殖抑制率為縱坐標(biāo)，如表2所示。

從表2中可以看出，細(xì)胞增殖抑制率隨著甲醇濃度增大而增加。當(dāng)甲醇濃度＜7%時，抑制率差別不顯著。

由圖12可見，CCK-8檢測試劑盒測定數(shù)值與細(xì)胞形態(tài)變化基本一致。

4 討論

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)由于操作簡便、試驗(yàn)條件可控以及不使用動物等優(yōu)點(diǎn)，在化學(xué)物質(zhì)毒性評價方面發(fā)揮著越來越重要的作用。目前，細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測方法主要有MTT法、中性紅法、乳酸脫氫酶（LDH）法、蛋白測定法及CCK-8細(xì)胞增殖-細(xì)胞毒性檢測試劑盒法[5]。但是不同化學(xué)物質(zhì)作用機(jī)制不同，每種方法的不足都可能對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，所以，對不同的試驗(yàn)體系采用不同的細(xì)胞毒性方法，可以更好地推斷其適用性。在本次試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)階段中，使用MTT、中性紅、LDH以及CCK-8等4種細(xì)胞毒性檢測試劑盒對HepG2細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，CCK-8試劑盒較其他細(xì)胞毒性檢測法操作簡便，無需多次進(jìn)行細(xì)胞操作，減少了試驗(yàn)過程中人為因素導(dǎo)致的試驗(yàn)誤差，降低了細(xì)胞污染的風(fēng)險[6]；與傳統(tǒng)的MTT法相比，CCK-8試劑穩(wěn)定，無放射性，并且對細(xì)胞沒有毒性，可以長時間孵育，更適合細(xì)胞毒力的檢測[7]。

以細(xì)胞活力作為甲醇對細(xì)胞毒性作用的參考，可以更加直觀地反應(yīng)毒理作用效果。細(xì)胞活力即在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比。本次研究中，細(xì)胞初始狀態(tài)良好，各組在試驗(yàn)后期顯現(xiàn)出不同的細(xì)胞狀態(tài)，其中的死細(xì)胞以細(xì)胞凋亡為主。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞產(chǎn)生特征性生物學(xué)變化的程序性死亡過程。凋亡細(xì)胞主要特征為細(xì)胞收縮變小變圓，染色質(zhì)裂解、核濃縮以及形成凋亡小體等[8]。本次試驗(yàn)使用的是HepG2細(xì)胞，該細(xì)胞來源于人類胚胎細(xì)胞瘤，所含生物轉(zhuǎn)化代謝Ⅰ相和Ⅱ相酶，用于體外遺傳毒性研究時，無需依賴外源性活化系統(tǒng)的加入，且該細(xì)胞分化程度較高，含有大量線粒體，被認(rèn)為是檢測外來化合物毒性的一個理想細(xì)胞系。同時，HepG2細(xì)胞易于培養(yǎng)，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，可以避免由于細(xì)胞狀態(tài)引起的細(xì)胞誤差。

在本研究中用甲醇作用細(xì)胞，隨著甲醇濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)變化越趨明顯。這說明一定濃度的甲醇會對細(xì)胞產(chǎn)生毒理作用。當(dāng)甲醇含量為1%～3%時對細(xì)胞影響甚微，與對照組相比差異不顯著。當(dāng)甲醇含量為4%、5%、6%、7%時，死亡細(xì)胞數(shù)量略有增加，但細(xì)胞存活率顯示與對照組差異不顯著。通過圖9可以看出，當(dāng)甲醇含量達(dá)到8%時死細(xì)胞數(shù)明顯增多，50%細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞變小變圓。

所以在使用甲醇作為溶劑時，要將濃度控制在8%以內(nèi)，對檢測結(jié)果的影響甚微。

圖12 CCK-8法測定細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果Fig.12 The cell viability results by the CCK-8

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Preliminary Research on the Toxicology of HepG-2 Cell Induced by Methanol

Sun Xiaofei1,Song Dahe2,Liu Shuyan1,Wan Chao1,Sun Yan3
(1.Liaoning Entry-Exit Inspection and Qurantine Bureau,Liaoning Dalian 116001; 2.Dalian Airport Entry-Exit Inspection and Qurantine Bureau,Liaoning Dalian 116001; 3.Dalian Forest Zoo,Liaoning Dalian 116000)

貝類毒素主要是由于海洋中有毒微藻或微生物產(chǎn)生，能夠在海洋生物尤其是雙殼貝類中富集的、對其他生物產(chǎn)生危害的一類小分子有毒化學(xué)物質(zhì)[1]。從類型上劃分，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的貝類毒素分為脂溶性貝類毒素和水溶性貝類毒素。其中脂溶性貝類毒素包括0A、AZA、BTX、PTX、YTX、CIs等6種聚醚類物質(zhì)，具有熱穩(wěn)定性，易融入甲醇、乙醚等非極性有機(jī)試劑中。所以在檢測此類型貝類毒素時，甲醇作為常用的萃取劑。甲醇本身具有毒性，在探討有機(jī)物的毒理作用時，首先要排除甲醇的毒理作用。有報道研究體積分?jǐn)?shù)在0～10%的甲醇毒性甚微[2]。

目前，國際上檢測AZA的方法主要采用小鼠生物測定法和高效液相色譜法（HPLC），尤其以高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）的應(yīng)用最為廣泛[3]。但是由于小鼠生物法低靈敏度、不能確定具體毒素成分等技術(shù)上的缺陷，而液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)使用成本昂貴，前處理過程繁瑣，不適合應(yīng)用到貝類的常規(guī)篩選中。在2001年愛爾蘭科研機(jī)構(gòu)就試圖建立一種快速、靈敏、特異的免疫學(xué)檢測方法。細(xì)胞毒性試驗(yàn)和蛋白磷酸酶抑制試驗(yàn)等也正處于探索之中[18]。基于細(xì)胞的敏感性，為了更加系統(tǒng)地研究甲醇的毒理作用，本文采用細(xì)胞增殖方法來測定甲醇的對細(xì)

Different concentrations of methanol were administered to HepG-2 cells,the changes of cell morphology was observed,and apoptosis-inducing effect of methanol on cells were determined by recording the absorbance value in the CCK-8 assay.The results showed that:the 8%concentration of methanol has the most significant cytotoxic effect,so the concentration of methanol should under 8%when it was used as a shellfish toxin solvent.

Methanol;HepG-2 cell;Cell viability胞的致死量。

R735.7

1672-9692(2015)12-0007-05

2015-11-14

孫曉飛（1983-），女，碩士，獸醫(yī)師，主要從事貝類毒素研究工作。

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013IK037）