袁 野，李守湖，李浩鵬，邢小勇，溫峰琴，包世俊，胡永浩★(.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；.中牧股份（乾元浩生物股份有限公司），河南 鄭州 450000)

免疫增強劑對新城疫-禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗抗體水平影響

袁 野1，2，李守湖1，李浩鵬2，邢小勇1，溫峰琴1，包世俊1，胡永浩1★
(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中牧股份（乾元浩生物股份有限公司），河南 鄭州 450000)

本研究旨在通過將不同種免疫增強劑與正?？乖考皽p量抗原含量的新城疫（La Sota株），禽流感（H5N1亞型Re-6株、Re-7株）5倍濃縮抗原按一定比例混合，制備成新城疫-禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗，分別免疫SPF雞。同時用不加免疫增強劑的新城疫-禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗免疫SPF雞作為對照組。結(jié)果表明，通過監(jiān)測雞免疫后不同天數(shù)的血清抗體水平，經(jīng)方差分析得知，相比于對照組的抗體水平，其中添加有囊素多肽、黃芪多糖、灰樹花多糖的疫苗免疫雞后產(chǎn)生的抗體水平均呈顯著提高，而香菇多糖與豬苓多糖則與對照組無顯著性差異。結(jié)果提示，在抗原含量正常或減量的情況下，囊素多肽、黃芪多糖、灰樹花多糖能起到抗體增強的效果，使其達(dá)到既能增強抗體又能降低成本的實用效果。

免疫增強劑；新城疫-禽流感；二聯(lián)三價滅活疫苗；抗體滴度

新城疫（Newcastle disease，ND）和禽流感（Avian influenza）是危害禽類的重大疾病，其病原分別是新城疫病毒和禽流感病毒，都屬于高度接觸性傳染病，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1-3]。目前，新城疫和禽流感的預(yù)防主要是接種疫苗[4-5]，雞新城疫疫苗主要有弱毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、基因工程苗[6-7]，而弱毒疫苗為目前市場上最常見的疫苗。禽流感現(xiàn)階段常見的疫苗為全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、重組活載體疫苗[8-9]。雖然使用常規(guī)疫苗免疫接種可以防制新城疫、禽流感，但在實際情況下常規(guī)單苗存在免疫繁瑣、免疫效果不盡理想、成本高等缺點，針對市場的需求，進(jìn)而研制出既節(jié)約成本又增強免疫效果的免疫增強劑。

免疫增強劑即廣義上的佐劑，都是通過調(diào)動免疫系統(tǒng)的功能，提高機體的病原微生物的特異性反應(yīng)來發(fā)揮其作用，是治療和預(yù)防疾病的重要物質(zhì)，特別是對疫苗發(fā)揮保護(hù)性作用起獨特的效果，能有效影響免疫反應(yīng)的質(zhì)量（型的控制、局部免疫以及細(xì)胞類型的控制），穩(wěn)定、便宜而且容易生產(chǎn)和保存[10-11]。本研究所用到的多種免疫增強劑，涉及小分子多肽類、多糖類等免疫增強劑能顯著提高機體免疫系統(tǒng)功能，增強疫苗的免疫效果，減少疾病發(fā)生[12-13]。探討各種免疫增強劑對雞體感染新城疫，禽流感的免疫調(diào)節(jié)作用，為應(yīng)對新城疫、禽流感能夠達(dá)到更加理想的免疫預(yù)防奠定了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 抗原及試驗動物抗原由乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠提供，包括新城疫（La Sota株）5倍濃縮抗原HA為11 log2，禽流感Re-7株5倍濃縮抗原HA為10 log2，禽流感Re-6株5倍濃縮抗原HA為10 log2。125只SPF雞（28日齡）均由乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠動物房SPF種蛋孵化。

1.2 主要試劑及儀器囊素三肽購自上海淘普生物科技有限公司。黃芪多糖、香菇多糖、豬苓多糖、灰樹花多糖均購自浙江方格藥業(yè)有限公司。注射用白油由法國MARCOL52注射白油提供。硬脂酸鋁購自上海遠(yuǎn)航試劑廠。司本-80和吐溫-80均購自廣東省肇慶市超能實業(yè)有限公司。無菌檢驗培養(yǎng)基由乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠提供。臺式微型剪切機T-18型購自德國IKA公。LS900激光顆粒粒度分析儀購自青島歐美克公司。八道移液器購自德國艾本德公司。

1.3 水相的制備①將1組事先配制好的囊素三肽溶液加入事先配置好的水相中；使?jié)舛冗_(dá)到每1 000 mL疫苗中含囊素三肽10 mg，囊素三肽含量達(dá)到1%。②將2組黃芪多糖、3組灰樹花多糖、4組香菇多糖、5組豬苓多糖原粉按一定比例溶于注射用水中制成相對應(yīng)的黃芪多糖、灰樹花多糖、香菇多糖、豬苓多糖溶液加入事先配置好的水相中，使其濃度達(dá)到疫苗總量的3%。

1.4 油相的制備將注射用白油、司苯-80、硬脂酸鋁按一定比例經(jīng)高壓滅菌混勻制成油相。

1.5 乳化將配制好的油相先與含有囊素三肽的水相用德國IKAT18型高速剪切機先進(jìn)行預(yù)乳化，待將水相加入完全后，按一定轉(zhuǎn)速、時間乳化結(jié)束，分裝于100 mL瓶中備用動物試驗。分別將預(yù)先配置好的含有黃芪多糖的水相、灰樹花多糖水相、豬苓多糖水相、香菇多糖水相溶液經(jīng)高壓滅菌后按一定比例加入5倍濃縮滅活抗原充分混勻后，緩緩加入油相，用德國IKAT18型高速剪切機預(yù)乳，待將水相加入后，按一定轉(zhuǎn)速，時間乳化結(jié)束，分裝于100 mL瓶中備用動物試驗。

1.6 劑型取1清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，應(yīng)呈油滴狀不擴散。

1.7 穩(wěn)定性取10 mL疫苗于離心管中，經(jīng)3 500 r/min離心15 min，應(yīng)不出現(xiàn)分層現(xiàn)象；疫苗在37℃左右條件，放置21 d不應(yīng)有破乳現(xiàn)象。

1.8 黏度用下口內(nèi)徑為1.2 mm、上口內(nèi)徑為2.7 mm的1 mL移液吸管在25℃左右的條件下吸取疫苗1 mL，令其垂直流出，記錄流出0.4 mL所需的時間。

1.9 顆粒度取5 μL疫苗混勻于10 mL白油中，置于LS900激光粒度分析儀中檢測。

1.10 無菌檢驗疫苗抽樣，分別取硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基2支，瓊脂培養(yǎng)基2支，葡萄糖培養(yǎng)基1支，每支接種疫苗0.2 mL分別放置于37℃、25℃培養(yǎng)箱中做無菌檢驗。

1.11 效力檢驗28日齡SPF雞125只分為12組，每組10只；第1～5組免疫添加含免疫增強劑及含有正?？乖康男鲁且?禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗0.3 mL；第6組免疫添加不含免疫增強劑及含有正?？乖康男鲁且?禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗0.3 mL；第7～11組免疫添加含免疫增強劑及含有1/5正?？乖康男鲁且?禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗0.3 mL；第12組免疫添加不含免疫增強劑及含有1/5正?？乖康男鲁且?禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗0.3 mL；另取5只作為空白對照。分別在免疫后的第14、21、28天采血收集血清，檢測抗體，經(jīng)spss對各個數(shù)據(jù)的方差分析統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 檢驗結(jié)果

2.1.1 疫苗物理性狀及無菌檢驗

2.1.2 抗體檢測結(jié)果 見表1。

表1 疫苗物理性狀及無菌檢驗結(jié)果Table1 sterility test results and physical properties of Vaccine

2.2 數(shù)據(jù)分析

2.2.1 抗原正常含量的情況下（Re-6株） 在14 d、21 d時相比于對照組的抗體水平，黃芪多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，囊素多肽組顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。在28 d時相比于對照組的抗體水平，囊素多肽組、灰樹花多糖組均極顯著提高，黃芪多糖組顯著提高，香菇多糖組、豬苓多糖組均與對照組無顯著性差異。

2.2.2 抗原含量為正常含量1/5的情況下（Re-6株）在14 d時相比于對照組的抗體水平，囊素多肽組，黃芪多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。在21 d、28 d時相比于對照組的抗體水平，黃芪多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，囊素多肽組顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。

表2 免疫后各組的Re-6 HI抗體水平方差分析表Table2 Analysis of variance on Re-6 HI antibody case of each group after immunizating

表3 免疫后各組的Re-7 HI抗體水平方差分析表Table3 Analysis of variance on Re-7 HI antibody case of each group after immunizating

2.2.3 在抗原正常含量的情況下（Re-7株） 在14 d時相比于對照組的抗體水平，黃芪多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，囊素多肽組顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。在21 d時相比于對照組的抗體水平，黃芪多糖極顯著提高，囊素多肽組與灰樹花多糖組均顯著提高，而香菇多糖與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。在28 d時相比于對照組的抗體水平，囊素多肽組、黃芪多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。

表4 免疫后各組的La Sota HI抗體情況水平方差分析Table4 Analysis of variance on La Sota HI antibody case of each group after immunizating

2.2.4 在抗原含量為正常含量1/5的情況下（Re-7株） 在14 d、21 d時相比于對照組的抗體水平，黃芪多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，囊素多肽組顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。在28 d時相比于對照組的抗體水平，囊素多肽組與黃芪多糖組均顯著提高，灰樹花多糖組顯著提高，香菇多糖組與豬苓多糖均無顯著提高。

2.2.5 在抗原正常含量的情況下（La Sota株） 在14 d時相比于對照組的抗體水平，囊素多肽組、黃芪多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，而香菇多糖與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。在21 d時相比于對照組的抗體水平，灰樹花多糖組極顯著提高，囊素多肽組與黃芪多糖組顯著提高，香菇多糖組與豬苓多糖組均無顯著提高；在28 d時囊素多肽組、黃芪多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。

2.2.6 在抗原含量為正常含量1/5的情況下（La Sota株） 在14 d、21 d時相比于對照組的抗體水平，囊素多肽組、黃芪多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。在28 d時囊素多肽組、黃芪多糖組、灰樹花多糖組、香菇多糖組與豬苓多糖組均無顯著提高。

3 討論

疫苗物理性狀方面，囊素三肽組疫苗的顏色無改變，呈乳白色，無分層現(xiàn)象，黏度、顆粒度也和普通疫苗無明顯差異，但黃芪多糖、灰樹花多糖、香菇多糖、豬苓多糖組疫苗顏色均有不同程度的改變，黏度、顆粒度也有不同程度的增加，并且在高速離心后穩(wěn)定性不理想，并且伴有沉淀析出。

相比于對照組的抗體水平，在抗原含量正常情況下，其中，添加有囊素多肽、黃芪多糖、灰樹花多糖的疫苗免疫雞后產(chǎn)生的抗體水平均呈顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。且在抗原含量減量的情況下其中添加有囊素多肽、黃芪多糖、灰樹花多糖的疫苗免疫雞后產(chǎn)生的抗體水平相比于添加香菇多糖、豬苓多糖及未添加免疫增強劑的抗體水平呈顯著提高，使其達(dá)到既能增強抗體又能降低成本的實用效果。

綜合以上疫苗物理性狀與抗體水平的分析結(jié)果來看，囊素三肽比較適合做新城疫-禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗的免疫增強劑。

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2016年《現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)》雜志征訂啟事

《現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)》雜志創(chuàng)刊于1972年，月刊，全年12期。郵發(fā)代號8-75，國內(nèi)刊號CN21-1515/S，國際刊號ISSN1672-9692。雜志內(nèi)容豐富、品質(zhì)卓越、裝幀精美、品位時尚，深受行業(yè)人喜愛。歡迎廣大讀者訂閱，如錯過郵局訂閱時間，可直接與本刊聯(lián)系。

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Study on immunostimulants on newcastle disease and avian influenza affected trivalent inactivated vaccine antibody levels

Yuan Ye1,2,Li Shouhu1,Li Haopeng2,Xing Xiaoyong1, Wen Fengqin1,Bao Shijun1,Hu Yonghao1*
(1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Gansu Lanzhou 730070; 2.China Animal Husbandry Industry CO.,LTD/QYH Biotech Company Limited),Henan Zhengzhou 450000)

The study was designed by the different types of immune enhancer and normal antigen content and the reduction of the antigen content of Newcastle(La Sota strain),avian influenza A (H5N1 Re-6 strain and Re-7 strain)five times concentrated antigen mixed in certain proportions prepared Newcastle and avian influenza trivalent inactivated vaccine,SPF chickens were immunized.At the same time,as a control group with Newcastle disease without immune enhancer and avian influenza trivalent inactivated vaccine SPF chickens.The results showed that the serum antibody levels by different days after immunizating monitoring chicken.Analysis of variance that comparing to the antibody levels between the control group,the antibody levels of produced with vaccine add Bursin polypeptides,APS and grifolan showed a significant increase.However,the group with Lentinan and PUPS was no significant difference between the control group.The results suggests that immunopotentiator with Bursin polypeptides,APS and grifolan can play an enhanced effect of the antibody in the case of reduction or normal on the antigen content,it is also enhance antibody but to reduce the cost of economic effect.

Immunostimulants;Newcastle and avian influenza;Duplex trivalent inactivated vaccine;Titer of antibody

S858.31

1672-9692(2015)12-0001-06

2015-11-23

袁野（1983-），男，河南鄭州人，博士研究生，主要從事生物制品、藥品的研發(fā)與生產(chǎn)。

胡永浩（1962-），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動物傳染病學(xué)及病原分子生物學(xué)的研究。