維生素D受體基因多態(tài)性與黎族老年骨質(zhì)疏松的易感性

吳昌新吳國志王暉1陳文生

(海南省農(nóng)墾總局醫(yī)院骨科，海南?？?71101)

摘要〔〕目的探討維生素D受體基因(VDR)多態(tài)性(rs11568820，F(xiàn)ok I酶切位點(diǎn)；rs1544410，Bsm I酶切位點(diǎn))與黎族老年骨質(zhì)疏松的易感性。方法入選118例骨質(zhì)疏松患者和140例健康對(duì)照人群，采用美國雙能X線測(cè)量?jī)x檢測(cè)BMD，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)技術(shù)檢測(cè)Fok I和Bsm I酶切位點(diǎn)多態(tài)性。結(jié)果全部標(biāo)本中，F(xiàn)F、Ff、ff基因型分布頻率為57.8%、37.2%、5.0%，BB、Bb、bb基因型分布頻率為17.4%、45.0%、37.6%。攜帶Ff基因型患骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)是攜帶FF基因者的1.13倍，攜帶ff基因型患骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)是攜帶FF基因型者的1.64倍；相比于Fok I多態(tài)性位點(diǎn)，攜帶Bb基因型患骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)是攜帶BB基因者的1.87倍，攜帶bb基因型患骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)是攜帶BB基因型者的4.21倍，風(fēng)險(xiǎn)更高。結(jié)論Fok I和Bsm I酶切位點(diǎn)多態(tài)性與老年骨質(zhì)疏松易感相關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕骨質(zhì)疏松；遺傳易感性；限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性；rs11568820；rs1544410

中圖分類號(hào)〔〕R68〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金(20158347)；海南省衛(wèi)生廳科學(xué)研究項(xiàng)目(瓊衛(wèi)2014-36)

1海南省干部療養(yǎng)院

第一作者：吳昌新(1969-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事骨科疾病研究。

骨質(zhì)疏松(OP)是受遺傳和環(huán)境等因素共同作用的多因子復(fù)雜性疾病〔1〕。維生素D受體(VDR)基因多態(tài)性被認(rèn)為是OP相關(guān)的重要遺傳因素〔2〕。研究表明，VDR基因不同區(qū)域的多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)其基因表達(dá)產(chǎn)生的影響不同。Bsm I位于第八號(hào)內(nèi)含子上，其多態(tài)性不影響VDR氨基酸序列；Fok I酶切位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始部位，其多態(tài)性可導(dǎo)致氨基酸序列長(zhǎng)度發(fā)生改變，從而影響該基因的表達(dá)調(diào)控〔3〕。本研究探討VDR基因多態(tài)性與黎族老年OP的遺傳易感性。

1材料和方法

1.1研究對(duì)象病例組：入選2013年3月至2014年2月門診確診為OP患者118例，平均年齡(69±5.2)歲，其中男78例，女40例。對(duì)照組：經(jīng)檢查確認(rèn)為非OP患者140例，平均年齡(65±6.8)歲，其中男78例，女62例。以上所有研究對(duì)象經(jīng)常規(guī)檢查，排除甲狀腺功能亢進(jìn)、糖尿病、原發(fā)性甲旁腺功能亢進(jìn)、肝腎功能不全、垂體和腎上腺功能異常等影響骨代謝的疾病。

1.2骨密度(BMD)測(cè)定258例研究對(duì)象采用美國雙能X線測(cè)量?jī)x(Dual X-ray absorption-metry，DXA；GE-Lunar Prodigy)檢測(cè)BMD。OP診斷標(biāo)準(zhǔn)參考1994年世界衛(wèi)生組織制定以BMD測(cè)量為基礎(chǔ)的OP癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，以BMD值減低2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差做為OP判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3DNA抽提抽取研究對(duì)象2 ml EDTA抗凝血，采用QIAamp DNA Blood Kits(Qiagen)試劑盒提取全血基因組DNA，采用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核酸質(zhì)量，并保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4多態(tài)性檢測(cè)PCR擴(kuò)增：分別設(shè)計(jì)包含F(xiàn)ok I和Bsm I酶切位點(diǎn)的PCR引物Fok I正義：5′- GGGTGGGTGGCACCAAGGAT-3′，反義：5′- CCTTTCCACTGGGGAGAGCC-3′；Bsm I正義：5′- CTGTGGTGTGTGGACGCTGA-3′，反義：5′- CCCTCTTCTCACCTCTAACCAG-3′。PCR提取如下：10倍reaction buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl24 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，上下游引物各5 μl，Taq酶5 U，去離子水補(bǔ)足體積至50 μl。PCR循環(huán)條件：95℃，5 min，40個(gè)循環(huán)：95℃，30s，60℃，30s，72℃，45s；72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物18 μl，加入2 μl Fok I內(nèi)切酶，37℃溫育3 h，反應(yīng)終止后，加入5 μl 10 mmol/L EDTA終止反應(yīng)，取10 μl進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。分型標(biāo)準(zhǔn)：等位基因均攜帶Fok I酶切位點(diǎn)(ff)，83 bp，183 bp兩條帶；等位基因分別攜帶和缺失Fok I酶切位點(diǎn)(Ff)，83 bp，183 bp，263 bp三條帶；等位基因均缺失FOK I酶切位點(diǎn)(FF)，263 bp一條帶。等位基因均攜帶Bsm I酶切位點(diǎn)(bb)，131 bp，192 bp兩條帶；等位基因分別攜帶和缺失Bsm I酶切位點(diǎn)(Bb)，131 bp，191 bp，322 bp三條帶；等位基因均缺失Bsm I酶切位點(diǎn)(BB)，322 bp一條帶。見圖1。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS18.0軟件行χ2檢驗(yàn)，并以相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR)比較不同基因型的患病風(fēng)險(xiǎn)。

M：Marker 2000，自上而下依次為2 000，1 000，750，500，250，100 bp；1：FF，263 bp一條帶；2：Ff，83 bp，183 bp，263 bp三條帶；3：ff，83 bp，183 bp；4：BB，322 bp一條帶；5：Bb，131，191，322 bp三條帶；6：bb，131 bp，192 bp兩條帶 圖1　不同基因型電泳圖

2結(jié)果

2.1Fok I酶切位點(diǎn)多態(tài)性與OP易感性分析全部標(biāo)本中，F(xiàn)F、Ff、ff基因型分布頻率為57.8%、37.2%、5.0%。病例組中分布頻率為53.4%(63例)、39.0%(46例)、7.6%(9例)，對(duì)照組中分布頻率為61.4%(86例)、35.7%(50例)、3.9%(4例)。攜帶Ff基因型患OP風(fēng)險(xiǎn)是攜帶FF基因者的1.13倍，攜帶ff基因型患OP風(fēng)險(xiǎn)是攜帶FF基因型者的1.64倍。Fok I酶切位點(diǎn)多態(tài)性與老年OP易感性相關(guān)。

2.2Bsm I酶切位點(diǎn)多態(tài)性與OP易感性分析全部標(biāo)本中，BB、Bb、bb基因型分布頻率為17.4%、45.0%、37.6%。病例組中分布頻率為10.5%(12例)、39.8%(47例)、49.7%(59例)，對(duì)照組中分布頻率為23.6%(33例)、49.3%(69例)、27.1%(38例)。攜帶Bb基因型患OP風(fēng)險(xiǎn)是攜帶BB基因者的1.87倍，攜帶bb基因型患OP風(fēng)險(xiǎn)是攜帶BB基因型者的4.21倍。Bsm I酶切位點(diǎn)多態(tài)性與老年OP易感性相關(guān)。

3討論

遺傳因素在OP的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要的作用，而在眾多遺傳因素中，VDR基因已成為熱門的研究基因之一〔4〕。VDR基因位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂，包含9個(gè)外顯子〔5〕。Bsm I位于第八號(hào)內(nèi)含子上，其多態(tài)性不影響VDR氨基酸序列；Fok I多態(tài)性位點(diǎn)位于該基因第二外顯子的起始區(qū)，該多態(tài)性位點(diǎn)的存在會(huì)導(dǎo)致編碼氨基酸的序列長(zhǎng)度改變，影響VDR基因mRNA的表達(dá)和穩(wěn)定，以及蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)作用，從而影響骨代謝以及相關(guān)代謝指標(biāo)的差異改變〔3，6〕。本研究與Mosaad等〔7〕的研究結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶Ff基因型患OP風(fēng)險(xiǎn)是攜帶FF基因者的1.13倍，攜帶ff基因型患OP風(fēng)險(xiǎn)是攜帶FF基因型者的1.64倍；攜帶Bb基因型患OP的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶BB基因者的1.87倍，攜帶bb基因型患OP的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶BB基因型者的4.21倍，風(fēng)險(xiǎn)更高。綜上所述，對(duì)于導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的遺傳因素仍然有待深入研究。我們的結(jié)果初步揭示了VDR基因多態(tài)性與OP之間存在一定的相關(guān)性，但是對(duì)于老年OP的遺傳因素、治療和預(yù)防策略仍需進(jìn)一步的深入研究。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-09-07修回〕

(編輯徐杰)