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輕度認知功能障礙患者尿液生物標志物

李乃靜李偉1何平

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院老年病科，遼寧沈陽110004)

摘要〔〕目的探討輕度認知功能障礙(MCI)患者尿液中潛在的生物標志物。方法通過超高效液相色譜-質譜聯(lián)用和代謝組學的方法，考查MCI患者和正常老年人尿液中代謝產物的擾動。對于超高效液相色譜-質譜聯(lián)用所產生的色譜圖，進行主成分分析顯示出疾病組和正常組之間的代謝物的變化。結果MCI患者的鞘氨醇類相對于正常組變化明顯，5個潛在的與MCI相關的生物標志物被發(fā)現(xiàn)。結論MCI患者的代謝物譜發(fā)生了明顯改變，這可以為MCI的診斷提供依據。

關鍵詞〔〕輕度認知功能障礙;尿液;標志物

中圖分類號〔〕R749.1〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81203002)；沈陽市科技局課題(No.F12-193-9-22)

1沈陽藥科大學藥分教研室

第一作者：李乃靜(1972-)，女，博士，副教授，主要從事老年病研究。

Urine metabolic profiling of mild cognitive impairment

LI Nai-Jing,LI Wei,HE Ping

Department of Gerontology,Shengjing Affiliated Hospital,China Medical University,Shengyang 110004,Liaoning,China

Abstract【】ObjectiveTo explore potential biomarkers in urine for mild cognitive impairment(MCI).MethodsUrine metabolic perturbations between MCI and healthy old person were investigated by using ultra performance liquid chromatography/mass spectrometry(UPLC/MS)and metabonomics approach.The principal component analysis(PCA)of UPLC/MS spectra showed that metabolic changes between two groups.ResultsThe PCA of UPLC/MS spectra showed that metabolic changes observed between MCI and control were clear.Five potential biomarkers in correlation with the extent of MCI were found.ConclusionsThe perturbation of phospholipids metabolism of MCI diseases may be important for clinical diagnosis and treatment.

【Key words】Mild cognitive impairment;Uine;Biomarkers

認知功能障礙性疾病主要包括阿爾茨海默病(AD)和輕度認知功能障礙(MCI)。在美國認知功能障礙性疾病每年至少造成10萬人死亡，僅次于心臟病、癌癥、腦卒中〔1〕。但目前尚不能對認知功能障礙性疾病早期診斷，更無有效的治療措施。代謝組學是研究外源性物質對生物體產生的整體效應，并以生物體內物質分子的整體作為對象,通過核磁共振(NMR)、液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)、氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)等高通量、高分辨、高靈敏度的現(xiàn)代儀器分析手段，定性或定量研究生物體液中的代謝產物，研究藥物對機體所形成代謝組的系統(tǒng)作用〔2,3〕。本研究采用代謝組學的方法，確定MCI患者的生物標志物。

1材料與方法

1.1試驗儀器與試劑液相系統(tǒng) Waters AcquityTMUltra Performance Liquid Chromatography(UPLC)system，美國 Waters 公司；質譜儀 Micromass Quattro microTMAPI 三重四級桿質譜儀 ，Waters 公司；高效液相-飛行時間質譜聯(lián)用儀(HPLC-ESI- QTOF- MS)，德國 Bruker 公司；臺式離心機(TGL-16C)，上海安亭科學儀器廠；高速臺式冷凍離心機(TGL-16)，湘儀離心機儀器有限公司；振蕩器CAY-1型液體快速混合器，北京長安儀器廠；微量取樣器(200 μl) Proline單道可調移液器，上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司；乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)美國 Fisher公司。

1.2試驗對象本研究選取中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院MCI患者(MCI組)和健康的老年志愿者(對照組)各20例，MCI組男10例，女10例，平均年齡(70±11)歲，體重指數(shù)(BMI)(26.5±2.2)kg/m2；對照組男10例，女10例，平均年齡(24.2±1.9)歲，BMI(24.2±1.9)kg/m2。本研究遵照《赫爾辛基宣言》的原則實施。健康老年受試者沒有神經和認知的疾病。

1.3試驗方法

1.3.1尿樣采集與預處理采取MCI患者和健康的老年志愿者的晨尿，約10 ml/h，加疊氮化鈉作為防腐劑，3 500 r/min離心10 min。取200 μl尿樣加入1.5 ml EP管中,加入400 μl甲醇沉淀蛋白，在4℃的低溫離心機中，15 000 r/min離心10 min,上清液轉移至另一EP管中，保持30℃恒溫，在N2氣流下吹干，用100 μl甲醇復溶，復溶后轉移至2 ml的進樣瓶中，進樣10 μl，用于UPLC-MS 分析。

1.3.2UPLC-MS代謝產物的圖譜采集代謝組學研究需要對生物樣品預處理，本實驗中采取甲醇沉淀尿液中蛋白。質譜檢測器采用正離子方式檢測。MCI患者和健康的老年志愿者的尿樣總離子流(TIC)色譜圖見圖1。

1.4UPLC-MS測定的方法學確證在分析實驗樣品之前，需要進行方法確證?？疾閮x器的精密度，日內穩(wěn)定性，方法的重復性。計算峰強度和峰保留時間的相對標準差(RSDs)。 儀器精密度：相同的樣品連續(xù)進5針，保留時間的RSDs從0.05%～0.45%，峰強度的RSD從2.5%～8.5%。處理后樣品穩(wěn)定性，通過分析一份樣品處理后，放置于保持在4℃的自動進樣器中，考察0，4，8，12，24 h的穩(wěn)定性,每個時間點進一針，結果顯示峰強度的 RSDs 從2.6%～8.5% ，保留時間的RSDs從0.05%～0.46%，表明方法精密度良好。

圖1　兩組研究對象尿樣TIC色譜圖

1.5數(shù)據分析和生物標志物的鑒定將原始圖譜導入 Markerlynx 軟件進行分析處理，設置主要分析參數(shù)，進行主成分分析(PCA)。主要參數(shù)設置如下：質譜的質量數(shù)誤差：0.01 D；噪音消除水平：10.0；初始和結束保留時間分別為0和20 min；低，高分子量分別設置成100，900 amu。從全掃描質譜圖中來分析生物標志物并且作圖。由碰撞誘導的裂解(CID)方式可以得到這些潛在生物標記物的裂解譜圖。一些標記物通過與標準物質對比色譜峰保留時間和二級質譜碎片特征。這些代謝物的全掃描質譜圖，通過查找可利用的生物化學數(shù)據庫，例如KEGG，METLIN等得到解釋。同時,一些生物標志物通過在相同液相條件下，對比在Bruker飛行時間質譜(ESI-QTOF-MS)上的保留時間和精確分子量來確認。

2結果

通過 PCA 分析，鑒定出了5個標志物。在正離子模式下，保留時間(min)和質荷比(m/z)成對出現(xiàn):9.4_274.3，8.2_246.3，9.5_318.3，12.0_330.4，10.8_346.4。通過在Waters UPLC/MS/MS儀器上分析分子量和裂解碎片之后，進一步分析了來自Bruker ESI-QTOF-MS的精確分子量數(shù)據和二級裂解碎片。通過比較兩者的一致性，查找 HMDB 和 KEGG 數(shù)據庫，這一類化合物被分別鑒定為274.3：C16 DHS，246.3：C14 DHS，318.3：C18 PHS，330.4:C20 DHS，346.4:C20 PHS。其對應的保留時間與m/z的總結見表1。MCI組鑒定出的5個標志物的含量明顯低于對照組，標志物含量的相對變化趨勢見表2。

表1MCI組生物標記物代謝組學特征

保留時間(min)m/z代謝物精確分子量測定分子量MCIvs.對照組9.4274.3C16DHS2274.2746274.2742(1.6ppm)↓8.2246.3C14DHS2246.2433246.2427(2.6ppm)↓9.5318.3C18PHS2318.3008318.3002(2.0ppm)↓12.0330.4C20DHS2330.3372330.3362(3.1ppm)↓10.8346.4C20PHS2346.3321346.3322(0.2ppm)↓

表2MCI組和對照組峰強度比較

指標對照組MCI組C14DHS210.067.401)C16DHS230.7928.501)C18PHS219.3714.601)C20DHS214.8010.601)C20PHS29.277.001)

與對照組比較：1)P<0.05

3討論

隨著人類老齡化社會進程的加快，老年人認知功能障礙性疾病逐年增多，正確診斷和識別MCI，對早期干預、防止癡呆的發(fā)生有重要意義。據報道MCI性疾病在發(fā)病早期代謝物中的一些生物學標志物的改變早于臨床癥狀的出現(xiàn)〔4〕。生物學標志物存在于腦脊液、血液和尿液等標本中，許多學者研究了腦脊液內可能的標志物，主要集中在Aβ蛋白、總Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白，檢測手段多為酶聯(lián)免疫吸附試驗和蛋白組學技術〔5，6〕，運用代謝組學技術來探索認知功能障礙性疾病生物標志物的研究鮮見報道。代謝組學是對限定條件下的特定生物樣品中所有代謝產物的定性定量分析，多應用于植物和微生物領域研究細胞的代謝組學。代謝組學技術能夠將基因和蛋白質表達的微小變化在代謝物上放大，從而使檢測更為容易，研究的樣品主要包括尿液、血液、唾液以及細胞或組織的提取液等。目前對認知功能障礙患者尿液代謝組學的研究國內尚未見報道。

本實驗結果表明MCI患者尿液中確定的生物標志物為5種神經鞘氨醇類化合物。鞘脂類及其衍生物鞘氨醇、 神經酰胺和雙氫鞘氨醇,被認為是重要的信號分子，介導了許多生物學功能，例如細胞生長、分化、老化和程序性死亡〔7〕。研究發(fā)現(xiàn),當人成纖維細胞進入衰老階段時,其內源性神經酰胺水平特異性顯著升高。同時這些細胞中的中性鞘磷脂酶的活性也提高〔8〕。在細胞中加入外源性神經酰胺可誘導這些細胞發(fā)生與衰老細胞類似的形態(tài)學改變。 因此,神經酰胺的形成可代表著一條特殊的細胞老化信號途徑。由此鞘氨醇類物質的變化可作為AD的生物標志物。近年來,利用具有細胞毒作用的藥物尤其是天然藥物甚至是膳食干預的途徑對老年癡呆的防治,已經愈來愈受到人們的重視,給大鼠食用神經酰胺或者其衍生物，對于大鼠在認知、學習、記憶方面的腦部功能均有有利的作用〔9〕。隨著鞘脂質及其代謝物與細胞凋亡相互關系究的明確及其相關理論的建立,利用富含鞘脂類物質的食物及其強化食品或直接以藥劑的形式進行預防和治療相關疾病必將成為可能。

本實驗將代謝組學的方法運用于認知功能障礙性疾病的研究，確定輕度認知功能障礙代謝物中特異、可靠的生物標志物；明確認知功能障礙嚴重程度與生物標記物的含量的相關性?？偨Y認知功能障礙性疾病內源性代謝物變化的規(guī)律，為認知功能障礙性疾病的特異性診斷提供科學支撐和新的理論依據，并為代謝組學的臨床應用研究探索新思路。

4參考文獻

1Goedert M,Spillantini MG.A century of Alzheimer’s disease〔J〕.Science,2006；314(5800):778-81.

2Lindon JC,Holmes E,Nicholson JK.Metabonomics and its role in drug development and disease diagnosis〔J〕.Expert Rev Mol Diagn,2004;4(3):189-99.

3Lindon JC,Holmes E,Nicholson JK.So what's the deal with metabonomics〔J〕.Anal Chem,2003;75(17):384A-91.

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9Shi YQ,Huang TW,Chen LM,etal.Ginsenoside-Rg1 attenuates amyloid-beta content regulates PKA/CREB activity and improves cognitive performance in SAMP8 mice〔J〕.J Alzheimers Dis,2010;19(3):977-89.

〔2014-05-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

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