多種藥物治療后骨質(zhì)疏松大鼠血清生化指標(biāo)與骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

王強(qiáng)戰(zhàn)祥波1王巍2楊琦3

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林長(zhǎng)春130026)

摘要〔〕目的比較多種藥物干預(yù)治療后血清生化指標(biāo)及骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的改變情況。方法以去卵巢法復(fù)制骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，以丹杞顆粒、依普拉芬、結(jié)合性雌激素、 進(jìn)行治療，飼養(yǎng)15 w后以腹主動(dòng)脈放血法處死大鼠，取大鼠左、右側(cè)骨在扭轉(zhuǎn)試驗(yàn)機(jī)驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行扭轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型組脛骨最大扭矩、最大扭轉(zhuǎn)角、最大扭轉(zhuǎn)切應(yīng)力顯著低于正常對(duì)照組、丹杞顆粒、依普拉芬、結(jié)合性雌激素αD3治療組(P<0.05)，以丹杞顆粒組大鼠脛骨最大切應(yīng)力、最大扭轉(zhuǎn)角大于對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)。結(jié)論老齡骨質(zhì)疏松模型組大鼠由于骨質(zhì)疏松導(dǎo)致股骨扭轉(zhuǎn)力學(xué)特性發(fā)生改變，丹杞顆粒、依普拉芬、結(jié)合型雌激素、 干預(yù)治療后扭轉(zhuǎn)力學(xué)特性均有一定提高，丹杞顆粒效果最好。

關(guān)鍵詞〔〕骨質(zhì)疏松；藥物干預(yù)；血清生化指標(biāo)；骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)

中圖分類號(hào)〔〕R714.257〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

通訊作者：楊琦(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事輔助生殖技術(shù)及產(chǎn)前診斷與骨質(zhì)疏松的研究。

1吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院婦產(chǎn)科2吉林大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科

3吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院婦產(chǎn)科

第一作者：王強(qiáng)(1970-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事女性生殖系統(tǒng)腫瘤及女性生殖內(nèi)分泌與骨質(zhì)疏松的研究。

堿性磷酸酶(ALP)是評(píng)價(jià)骨形成和骨轉(zhuǎn)換的重要指標(biāo)。骨質(zhì)疏松老年人發(fā)病率高，女性是本病的最大受害者，尤其是絕經(jīng)后的女性，由于雌激素分泌水平降低，引起內(nèi)分泌失調(diào)和紊亂，引起骨質(zhì)疏松〔1〕。以往多以單一藥物治療人或動(dòng)物骨質(zhì)疏松模型為研究對(duì)象居多。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)比分析中藥丹杞顆粒、西藥依普拉芬、結(jié)合型雌激素干預(yù)治療去卵巢骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的效果。

1材料與方法

1.1動(dòng)物6月齡Wistar大鼠10只，12月齡Wistar大鼠50只，體重280～320 g，均購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

1.2藥品西藥依普拉芬，武漢濱湖制藥廠結(jié)合型雌激素片蘇州立達(dá)制藥有限公司，丹杞顆粒邯鄲摩羅丹藥業(yè)有限公司，昆明貝克諾頓制藥有限公司αD3。

1.3大鼠分組與骨質(zhì)疏松模型復(fù)制6月齡Wistar大鼠設(shè)為正常對(duì)照一組12月齡大鼠隨機(jī)分為骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型組10只，骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型以丹杞顆粒治療組10只，αD3治療組10只，依普拉芬治療組10只，結(jié)合型雌激素治療組10只，所有大鼠均在籠中飼養(yǎng)，各組大鼠均自由攝食、飲水。對(duì)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型組大鼠和各治療組動(dòng)物于0 w手術(shù)，摘除雙側(cè)卵巢；丹杞顆粒治療組、依普拉芬治療組、結(jié)合型雌激素治療組大鼠每天相應(yīng)給服丹杞顆粒0.9 g/kg、依普拉芬100 mg/kg、結(jié)合型雌激素2 mg/kg。各組大鼠飼養(yǎng)15 w之后，以腹主動(dòng)脈放血法處死各組大鼠，分別于各組大鼠心臟取血，分別取8 ml血液，之后將血液置于10 ml離心管中，以低溫離心機(jī)對(duì)血液進(jìn)行離心處理，4 000 r/min離心7 min，離心溫度4℃，血液離心完成后，將血清放置在5 ml凍存管內(nèi)保存待用。之后分別將各組大鼠麻醉以后，解剖大鼠，將大鼠左、右側(cè)股骨取出后，將各組大鼠股骨分別以生理鹽水浸濕紗布進(jìn)行包裹后，-20℃冰箱內(nèi)存放。

1.4主要儀器BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析儀(成都泰盟公司生產(chǎn))，Poegcuts型切片機(jī)(德國(guó)OPTON公司生產(chǎn))YD-51電鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器四廠生產(chǎn))。P-Max 3500FL型多功能熒光酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技有限公司生產(chǎn))。

參考文獻(xiàn)1.5血清生化指標(biāo)測(cè)定按〔3〕的方法對(duì)血清中的鈣、磷、ALP、抗酒石酸酸性磷酸酶(STR-ACP)進(jìn)行測(cè)試，試劑盒為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，以鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法測(cè)定血鈣；以孔雀綠直接顯色法進(jìn)行血磷的測(cè)定，以酶標(biāo)法檢測(cè)血清中ALP 和STR-ACP 。

1.6大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)測(cè)量將大鼠右側(cè)股骨放入10%甲醛緩沖液固定3 d。脫鈣-將骨組織放入10%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(含0.1 %DEPC水)中脫鈣45 d。脫水-組織縱斷取材后,經(jīng)梯度酒精(80%乙醇24 h,95%12 h),以二甲苯反復(fù)浸泡2 次，30 min/次，之后進(jìn)行對(duì)組織以樹脂進(jìn)行包埋，之后取出包埋組織浸入石蠟中，更換石蠟反復(fù)浸泡3 次，30 min/次，待石蠟?zāi)毯螅瓜瀴K與樣品脫離，以切片機(jī)進(jìn)行切片,切片厚度為5 μm，之后將切片置于蒸餾水中,將載玻片撈出后，放置于60℃ 環(huán)境箱中過夜。 之后將切片在二甲苯溶液中脫蠟30 min反復(fù)2次;然后經(jīng)100% 乙醇5 min反復(fù)2次;95%乙醇5 min,反復(fù)2次;80%乙醇5 min，之后對(duì)樣品進(jìn)行水洗，之后將樣品置于蘇木素染色液中染色15 min,之后以自來(lái)水進(jìn)行沖洗,之后以1%鹽酸酒精分化樣品1 min,之后對(duì)樣品進(jìn)行水洗,之后以弱氨水對(duì)樣品返蘭30 s,對(duì)樣品水洗后,以伊紅對(duì)樣品染色15 min,水稍洗后,以80%乙醇稍洗,以95%乙醇反復(fù)2次，5 min/次,以,100%乙醇5 min。以二甲苯反復(fù)2次，5 min/次,以中性樹脂膠封片,隨機(jī)對(duì)每張切片選取5個(gè)視野,以BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析儀測(cè)量各組大鼠股骨骨小梁面積(Tb.r),骨小梁周長(zhǎng)(Tb.Pm),骨小梁相對(duì)體積(TBV)，骨小梁面積(骨髓面積+小梁面積)，骨小梁平均厚度(MTT)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1大鼠血鈣、血磷、ALP、STR-ACP測(cè)量結(jié)果模型組、血鈣、血磷、STR-ACP、ALP與正常對(duì)照組、丹杞顆粒治療組、依普拉芬治療組、結(jié)合型雌激素治療組差異顯著(P<0.05)。丹杞顆粒治療組、依普拉芬治療組、正常對(duì)照組血鈣、血磷、STR-ACP、ALP差異顯著(P<0.05)。見表1。

2.2各組骨組織形態(tài)學(xué)計(jì)量指標(biāo)比較丹杞顆粒治療組、依普拉芬治療組、結(jié)合型雌激素治療組骨小梁平均間距(Tb、SP)、MTT、Tb、Pm、Tb.r、TBV大于模型組(P<0.05)。見表2。

組別血鈣(mmol/L)血磷(mmol/L)堿性鹽酸酶(U/L)STR-ACP(U/L)ALP(U/L)正常對(duì)照組2.36±0.031)3.86±0.51)129.6±8.112.4±1.121)26.8±5.131)模型組2.51±0.034.62±0.6104.3±9.215.1±1.7136.2±6.12丹杞顆粒治療組2.374±0.021)2)3.88±0.61)2)129.8±8.712.6±1.681)2)27.1±6.211)2)依普拉芬治療組2.34±0.041)2)3.92±0.81)2)128.9±7.412.8±1.321)2)27.6±5.671)2)結(jié)合型雌激素治療組2.41±0.031)4.120.71)117.9±6.813.6±1.471)30.6±6.351)αD3治療組2.51±0.034.59±0.8105.3±9.314.3±1.6734.8±7.14

與模型組比較：1)P<0.05；與正常對(duì)照組比較：2)P<0.05；下表同

組別Tb.Ar(μm2)Bv/TV(%)MTT(μm)Tb.Pm(μm)Tb.SP(μm)正常對(duì)照組3.31±0.1732.87±1.2246.74±1.6336.79±1.76119.21±1.82模型組2.46±0.1125.81±0.9738.46±1.5832.64±1.58102.61±1.73丹杞顆粒治療組3.25±0.1431.64±1.281)46.18±0.961)35.98±1.711)118.26±1.551)依普拉芬治療組3.19±0.1229.31±0.981)44.25±1.261)34.96±1.831)109.22±1.611)結(jié)合型雌激素治療組3.08±1.328.26±1.141)42.38±1.161)33.88±1.781)108.11±1.441)αD3治療2.62±1.326.08±1.539.77±1.2633.43±1.62104.33±1.57

3討論

骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型大鼠通過以中藥丹杞顆粒、西藥依普拉芬、結(jié)合型雌激素干預(yù)治療后起到了降低大鼠血清血鈣和STR-ACP 的作用。這有利于促進(jìn)去卵巢大鼠骨鈣化，有利于骨細(xì)胞對(duì)鈣的吸收，有利于促進(jìn)骨鈣化，提高骨密度(BMD)，起到提高骨的內(nèi)在質(zhì)量和性能的作用〔4〕。

本研究結(jié)果證明，骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型通過以中藥丹杞顆粒、西藥依普拉芬、結(jié)合型雌激素干預(yù)治療后，對(duì)骨質(zhì)疏松模型大鼠都有一定的療效，尤其是丹杞顆粒效果最好。學(xué)者們對(duì)雌激素治療骨質(zhì)疏松也進(jìn)行了一定的研究，章曉霜〔5〕對(duì)不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)和雌激素聯(lián)合作用對(duì)去卵巢大鼠骨骼影響進(jìn)行了研究；曹珍山等〔6〕證明尼爾雌醇對(duì)防治骨質(zhì)疏松具有一定的作用。金勛杰等〔7〕以補(bǔ)骨膠囊和炔雌醇聯(lián)用藥對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松的預(yù)防及對(duì)子宮刺激作用進(jìn)行了研究，得出補(bǔ)骨膠囊和炔雌醇聯(lián)用可有效抑制炔雌醇對(duì)大鼠子宮刺激作用，得出了補(bǔ)骨膠囊與炔雌醇合用可有效防治骨質(zhì)疏松的結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往的研究均證明，雌激素對(duì)預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松具有一定的作用，但雌激素的副作用不容忽視，長(zhǎng)期服用雌激素易患深靜脈血栓和股骨頭壞死等。

依普拉芬是治療骨質(zhì)疏松的西藥，已用于臨床治療骨質(zhì)疏松。張欣等〔8〕對(duì)女性圍絕經(jīng)骨質(zhì)疏松以依普拉芬進(jìn)行干預(yù)后的治療效果進(jìn)行了觀察。得出了依普拉芬有抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成的作用,能有效預(yù)防和治療婦女圍絕經(jīng)期癥狀和骨質(zhì)疏松,可以作為激素替代療法的補(bǔ)充的結(jié)論。韋永中等〔9〕研究表明依普拉芬對(duì)防止骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型大鼠骨丟失具有一定作用。但其作為化學(xué)合成的西藥都具有一定副作用，長(zhǎng)期服用時(shí)臟器等會(huì)造成傷害，其價(jià)格昂貴，也不易被患者接受。

沈鐵城〔10〕對(duì)維生素D治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松的療效進(jìn)行了分析，得出服用維生素+鈣劑可迅速改善骨質(zhì)疏松病人的癥狀，并增加BMD，降低骨折發(fā)生率的結(jié)論。

4參考文獻(xiàn)

1李全義，劉時(shí)璋，羅振群,等.骨髓損傷后骨代謝形態(tài)改變的髂骨形態(tài)計(jì)量學(xué)研究〔J〕，第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007;28(15)：1421-4.

2張光，李祎，呂俊峰,等.正常人的骨密度定量CT測(cè)量分析〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2003;29(1)：112-4.

3李世昌，季瀏，劉體偉,等.不同方式運(yùn)動(dòng)對(duì)去卵巢大鼠骨密度、骨生物力學(xué)及代謝指標(biāo)的影響〔J〕.體育學(xué)刊,2012;19(2):132-7.

4鐘顯春，羅民，李新穎，等.幾種藥物治療骨質(zhì)疏松模型大鼠股骨蠕變特性的對(duì)比分析〔J〕.生物醫(yī)學(xué)工程研究，2012;31(3):180- 3.

5章曉霜.不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)和雌性激素聯(lián)合作用對(duì)去卵巢大鼠股骨影響的實(shí)驗(yàn)研究〔D〕.上海：華東師范大學(xué)博士論文,2004.

6曹珍山，葉長(zhǎng)清，袁麗珍,等.尼爾雌醇防治骨質(zhì)疏松癥的形態(tài)計(jì)量學(xué)研究〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,1992;12(2)：99-101.

7金勛杰，吳鐵，李清南,等.補(bǔ)骨膠囊與17-OC炔雌醇聯(lián)合用藥對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松的預(yù)防及對(duì)子宮刺激作用的研究〔J〕.中國(guó)骨傷,2003;16(5):272-4.

8張欣,李少聞,董春利,等.依普拉封治療婦女圍絕經(jīng)期癥狀及骨質(zhì)疏松的效果〔J〕.中國(guó)婦幼保健，2009;24(2)：215-6.

9韋永中，陶松年，包麗華,等.依普拉芬對(duì)去勢(shì)大鼠骨丟失防治作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1999；19(2)：215-6.

10沈鐵城.維生素D3治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的療效觀察〔J〕.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2004;14(3)：212-3.

〔2015-02-18修回〕

(編輯袁左鳴)