黃連素抑制JNK激酶活性緩解Aβ1～42誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

孫鈿

(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北宜昌443001)

摘要〔〕目的探討黃連素(BR)能否緩解Aβ1～42誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及其可能機(jī)制。方法在人胚腎細(xì)胞-293(HEK293)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)Aβ前體蛋白(APP)的細(xì)胞系(HEK293/APP)中給予不同濃度聚集狀A(yù)β1～42處理，研究Aβ1～42的細(xì)胞毒性。HEK293/APP細(xì)胞預(yù)先給予20 μg/ml的黃連素24 h處理后給予Aβ1～42處理12 h。通過CCK8檢測細(xì)胞活性，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，Western印跡檢測蛋白變化。結(jié)果BR能夠顯著改善HEK293/APP細(xì)胞由Aβ1～42所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和凋亡(P<0.05)，抑制JNK和Caspase-3的激活(P<0.05)。結(jié)論BR能夠緩解Aβ1～42誘導(dǎo)的凋亡，其可能機(jī)制是通過抑制JNK激活進(jìn)而抑制Caspase-3的活化來對(duì)抗凋亡。

關(guān)鍵詞〔〕黃連素；阿爾茨海默?。籄β1～42；凋亡

中圖分類號(hào)〔〕R733.71〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：孫鈿(1974-)，男，主治醫(yī)師，主要從事阿爾茨海默病相關(guān)研究。

阿爾茨海默病(AD)主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶減退和認(rèn)知功能障礙〔1〕。AD的主要病理特征是細(xì)胞外老年斑沉積，細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)，神經(jīng)元丟失和突觸功能障礙。AD的發(fā)病原因目前尚不明確，主要有Aβ學(xué)說，Tau蛋白過度磷酸化學(xué)說和氧化應(yīng)激等學(xué)說〔2〕。Aβ是由39～43個(gè)氨基酸組成的短肽，是老年斑的重要成分，在AD的病理過程中發(fā)揮重要的作用。體外實(shí)驗(yàn)以及AD轉(zhuǎn)基因鼠模型都證實(shí)Aβ能夠誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)元丟失。Aβ能夠激活凋亡通路中的Caspases激酶來誘發(fā)凋亡〔3〕。黃連素(BR)，主要存在于中草藥黃連、黃柏、三顆針等植物中。BR能對(duì)抗多種病原微生物，例如結(jié)核桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、肺炎球菌、白喉?xiàng)U菌以及傷寒桿菌等都有抑制作用，臨床上常用來治療細(xì)菌性痢疾、痢疾、細(xì)菌性胃腸炎等消化道疾病〔4〕。BR能夠改善AD模型大鼠的氧化應(yīng)激損傷。BR也能夠改變Aβ前體蛋白加工，從而減少Aβ生成〔5〕。BR可以抑制乙酰膽堿酯酶活性。BR能夠逆轉(zhuǎn)Tau蛋白過度磷酸化〔6〕。本研究探討B(tài)R對(duì)Aβ誘導(dǎo)凋亡的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1試劑和抗體BR購買自四川鴻運(yùn)生物公司。Western印跡所用特異性一抗購買自美國Protein Tech 公司，ECL顯示二抗購買自美國CST公司。細(xì)胞培養(yǎng)試劑購買自美國Invitrogen公司。

1.2Aβ1～42聚集體的制備Aβ1～42從上海強(qiáng)耀生物科技有限公司買回，溶解于氨水中，用磷酸鹽緩沖液(PBS)中稀釋到0.1 mg/ml，37℃中孵育24 h形成聚集體。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和給藥HEK293細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS的1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2環(huán)境中。細(xì)胞分成三組：空白對(duì)照組，給予DMSO處理；模型組，給予20 μmol/L的Aβ1～42處理12 h；治療組，預(yù)先給予20 μg/ml的BR24 h后再用20 μmol/L的Aβ1～42處理12 h。

1.4細(xì)胞活性檢測采用Dojindo Laboratories公司的CCK8試劑盒來檢測細(xì)胞活性。96孔板中每孔加入100 μl含103細(xì)胞的培養(yǎng)基。經(jīng)不同時(shí)間培養(yǎng)后，每孔加入10 μl黃色的CCK8溶液孵育2 h，然后在酶標(biāo)儀中檢測450 nm處吸光度值。

1.5凋亡檢測采用BD公司流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況。細(xì)胞收集后用PBS沖洗兩次后，再加5 μl Annexin V、200 μl Annexin V-FITC結(jié)合液、5 μl PI避光孵育15 min后上機(jī)進(jìn)行流式檢測。

1.6Western印跡收集細(xì)胞后用碧云天公司的細(xì)胞裂解液裂解，超聲處理后用BCA法檢測樣品蛋白濃度。等量蛋白樣品在10%的SDS膠中電泳，然后轉(zhuǎn)移到NC膜上，用含有3%BSA封閉液封閉40 min，4℃孵育一抗過夜。繼續(xù)二抗室溫孵育1 h，采用ECL顯色并分析灰度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件行ANOVA分析。

2結(jié)果

2.1BR緩解Aβ1～42誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞毒性分別給予HEK293細(xì)胞0、5、10、20、50 μmol/L Aβ寡聚體處理12 h，CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性，分別(100±3.2)%、(97±2.4)%，(73±3.1)%、(61±4.4)%、(42±5.2)%，顯示10 μmol/L時(shí)，HEK293的細(xì)胞活性已經(jīng)顯著下降(P<0.01)，后續(xù)試驗(yàn)采用20 μmol/L濃度。預(yù)先外源性給予10 μmol/L BR處理后能夠顯著緩解20 μmol/L 的Aβ1～42引起的細(xì)胞毒性(P<0.01)，對(duì)照組、模型組及治療組細(xì)胞活性分別是為(100±2.1)%、(64±5.2)%、(96±2.7)%，表明BR能夠緩解Aβ1～42誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞毒性。

2.2BR緩解Aβ1～42誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞凋亡預(yù)先外源性給予10 μmol/L BR處理后能夠顯著緩解20 μmol/L的Aβ1～42引起的凋亡(P<0.05)，對(duì)照組、模型組及治療組細(xì)胞凋亡率分別為(2.9±0.12)%、(8.9±0.21)%、(3.2±0.16)%。

2.3BR緩解Aβ1～42引起的Caspase-3活化Western印跡顯示Aβ1～42處理后c-Caspase-3顯著升高，但是預(yù)先給予10 μmol/L黃連素處理后，c-Caspase-3水平顯著下降(P<0.05，圖1)，各組c-Caspase-3 相對(duì)灰度值為1.0 ± 0.12，1.65 ± 0.22，1.12 ± 0.13，表明BR可以緩解Aβ1～42引起的細(xì)胞凋亡。

2.4BR緩解Aβ1～42誘導(dǎo)的JNK激活20 μmol/L的Aβ1～42能夠顯著促進(jìn)JNK激活，而10 μmol/L BR預(yù)處理24 h后能夠抑制Aβ1～42誘導(dǎo)的JNK的激活(P<0.05，圖2)。各組p-JNK的相對(duì)灰度值依次為1.0±0.14，1.43±0.11，1.02±0.15。表明BR可能通過抑制JNK的激活進(jìn)而發(fā)揮其抗凋亡的作用。

圖1　BR緩解Aβ 1～42引起的Caspase-3活化

圖2　BR緩解Aβ 1～42誘導(dǎo)的JNK激活

3討論

AD是老年人群中最常見的癡呆形式，它是一種漸進(jìn)性的神經(jīng)退行性疾病。它導(dǎo)致大腦內(nèi)特定區(qū)域出現(xiàn)大量神經(jīng)元丟失，例如海馬、內(nèi)嗅皮層等。AD的特征性神經(jīng)病理學(xué)改變是細(xì)胞外淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)，以及突觸和神經(jīng)元的丟失。老年斑的主要成分是Aβ1～42。Aβ1～42能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)和突觸活性，腦內(nèi)異常聚集的Aβ1～42能破壞正常的突觸活性，并且能夠誘發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，神經(jīng)毒性和凋亡現(xiàn)象〔7〕，因此研究Aβ1～42的毒性作用機(jī)制以及預(yù)防保護(hù)措施在AD研究領(lǐng)域中有著重要的意義。

BR在臨床中作為非處方藥廣泛應(yīng)用于治療胃腸炎、腹瀉等。近年來藥理學(xué)研究也表明BR具有顯著的抗心律失常、抗心力衰竭、改善胰島素抵抗、降低膽固醇、抗血小板、抗炎等重要作用，因而黃連素在心腦血管系統(tǒng)疾病方面可能有著重要的應(yīng)用前景，并日益受到重視〔8〕。

越來越多的證據(jù)表明BR在AD的發(fā)病過程中也發(fā)揮重要作用。BR能夠改善AD模型大鼠的氧化應(yīng)激損傷，影響Aβ前體蛋白加工，抑制乙酰膽堿酯酶活性，降低Tau蛋白過度磷酸化，表明BR對(duì)于AD的研究和治療有著重要意義〔5～7〕。本研究中發(fā)現(xiàn)20 μmol/L的Aβ1～42能夠引起HEK293細(xì)胞活性降低，出現(xiàn)凋亡，并伴隨著JNK和Caspase-3的激活，而給予BR預(yù)處理則能夠逆轉(zhuǎn)Aβ1～42誘導(dǎo)的一系列細(xì)胞毒性和凋亡效應(yīng)，發(fā)揮重要的抗凋亡作用。JNK信號(hào)通路在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面起重要作用，JNK激酶控制著很多細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖分化、轉(zhuǎn)化、凋亡等過程〔9〕。以往研究發(fā)現(xiàn)JNK參與了Aβ1～42誘發(fā)的細(xì)胞毒性作用，抑制JNK活性能夠緩解Aβ1～42引起的細(xì)胞毒性〔10〕。這些都表明JNK的激活對(duì)于Aβ1～42誘發(fā)細(xì)胞毒性發(fā)揮重要作用，而BR的對(duì)抗Aβ1～42誘導(dǎo)的凋亡的機(jī)制可能是通過它抑制JNK激活，進(jìn)而抑制Caspase-3活化來實(shí)現(xiàn)的。

總之，目前研究表明BR能夠緩解Aβ1～42誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，其預(yù)防保護(hù)機(jī)制可能是通過抑制JNK激活來抑制Caspase-3的活化，抑制凋亡效應(yīng)，表明BR可以作為研究Aβ1～42細(xì)胞毒性作用的新靶點(diǎn)。

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〔2014-05-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)