非諾貝特對(duì)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α和單核細(xì)胞趨化蛋白-1的影響

陳福生蒲曉群1

(株州愷德心血管病醫(yī)院心內(nèi)科，湖南株洲412007)

摘要〔〕目的觀察非諾貝特對(duì)氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖、單核細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα) 和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的影響。方法體外培養(yǎng)HUVEC株，第3～5代用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分3組：①空白對(duì)照組；②ox-LDL組(100 mg/L)；③非諾貝特組：先將非諾貝特10、50、100 μmol/L分別作用于內(nèi)皮細(xì)胞24 h，然后加ox-LDL(100 mg/L)作用于細(xì)胞24 h。采用細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附法分析檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液PPARα、MCP-1含量；采用四唑鹽比色法檢測(cè)各孔的吸收度(OD)，以評(píng)價(jià)增殖效果。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，100 mg/L ox-LDL促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖(P

關(guān)鍵詞〔〕氧化型低密度脂蛋白；臍靜脈；單核細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α；單核細(xì)胞趨化蛋白-1；非諾貝特；動(dòng)脈粥樣硬化

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R39〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院心內(nèi)科

第一作者：陳福生(1973-)，男，碩士，主要從事冠心病介入治療、藥物治療研究。

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是缺血性心腦血管疾病的基礎(chǔ)。AS不僅僅是脂質(zhì)的沉積，更是一種慢性炎癥性疾病〔1〕。單核細(xì)胞在AS病變損傷區(qū)黏附、聚集并且進(jìn)入血管內(nèi)膜下組織，進(jìn)而吞噬氧化低密度脂蛋白等，轉(zhuǎn)化成為泡沫細(xì)胞，這是AS形成早期的關(guān)鍵步驟之一。對(duì)于單核細(xì)胞的黏附和聚集，血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1、E-選擇素(E-selectin)、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、白細(xì)胞介素(IL)-8等都起了非常重要的作用，其中MCP-1對(duì)單核細(xì)胞的趨化起著尤為關(guān)鍵的作用〔2，3〕單核細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α活化能抑制炎癥反應(yīng)而對(duì)AS產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察貝特類(lèi)藥物非諾貝特通過(guò)激活PPARα，對(duì)氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖及MCP-1分泌的影響，為預(yù)防AS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料HUVECs購(gòu)自澳賽爾斯生物技術(shù)(上海)有限公司。ox-LDL購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所。DMEM、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；PPARα、MCP-1試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，M199干粉培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司。羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。非諾貝特及MTT購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；培養(yǎng)板購(gòu)自加拿大Biofil公司。

1.2方法

1.2.1HUVECs的培養(yǎng)和處理取HUVECs解凍，待復(fù)蘇后，加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3～5代HUVECs進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml接種于6孔培養(yǎng)板，每孔分別2 ml，置于CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h。然后更換乏血清培養(yǎng)基(M199+2%胎牛血清+1%HEPES)繼續(xù)培養(yǎng)6 h，使細(xì)胞同步化于G0/G1實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為3組：①空白對(duì)照組；②ox-LDL組(100 mg/L)；③非諾貝特組：非諾貝特10、50、100 μmol/L。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，其中非諾貝特組先用上述藥物預(yù)處理細(xì)胞24 h后，再給ox-LDL(100 mg/L)作用于細(xì)胞24 h。然后用0.125%胰蛋白酶進(jìn)行消化，制備細(xì)胞懸液用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)上清液PPARα、MCP-1含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。過(guò)程簡(jiǎn)述如下：酶標(biāo)板中，各孔均加入50 μl孵育液，標(biāo)準(zhǔn)孔內(nèi)加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)PPARα、MCP-1溶液50 μl，待測(cè)孔內(nèi)加入稀釋后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液50 μl，再加入Biotin標(biāo)記的抗PPARα、MCP-1 50 μl，室溫孵育2 h后，洗板4次，加入HRP標(biāo)記的工作液100 μl，室溫孵育30 min，洗板后加入顯色液100 μl，再次室溫避光孵育25 min，加入終止液100 μl終止反應(yīng)，以酶標(biāo)儀450 nm讀取吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)液濃度作圖，并擬和吸光度值相對(duì)應(yīng)于MCP-1、PPARα的濃度的計(jì)算公式，計(jì)算待測(cè)樣本中PPARα、MCP-1的含量，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PPARα、MCP-1的濃度。

1.2.3MTT法評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖MTT法將HUVECs以每孔1×104/ml接種于96孔板，每孔200 μl，各實(shí)驗(yàn)組ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，每孔加入MTT(濃度為5 mg/ml)繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，加入DMSO 顯色酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度A630和A570，A630-A570即為測(cè)定值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件行t檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1HUVECs形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，正常的內(nèi)皮細(xì)胞起初呈圓形或橢圓形，多呈小團(tuán)存在，4 h后開(kāi)始貼壁，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，早期細(xì)胞呈小多角形、球形、團(tuán)狀，逐漸生長(zhǎng)成梭形，胞體呈多角形，相互嵌合，呈鋪路石狀鑲嵌排列，細(xì)胞透明度大。

2.2各組及不同濃度非諾貝特對(duì)HUVECs增殖及PPARα、MCP-1分泌的影響各組及不同濃度非諾貝特對(duì)HUVECs增殖及PPARα、MCP-1分泌的影響，見(jiàn)表1。

組別HUVECs增殖PPARα(pg/ml)MCP-1(pg/ml)空白對(duì)照組0.425±0.026128.68±56.76150.13±69.29ox-LDL組0.767±0.0481)78.56±38.421)889.26±92.391)非諾貝特10μmol/L0.656±0.0381)286.96±52.761)629.41±51.971)非諾貝特50μmol/L0.576±0.0322)516.86±65.462)432.56±46.192)非諾貝特100μmol/L0.465±0.0262)767.69±89.762)292.66±34.652)

與空白對(duì)照組比較:1)P<0.01；與ox-LDL組比較:2)P<0.01

3討論

AS是重要的心血管疾病之一，其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。近年研究認(rèn)為，AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)是血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)的損傷，低密度脂蛋白(LDL)通過(guò)損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙彌散進(jìn)入血管內(nèi)皮下，被自由基和活性氧等修飾氧化為ox-LDL〔4〕。ox-LDL可誘導(dǎo)多種炎性因子的表達(dá)，如細(xì)胞間黏附因子-1、VCAM-1、MCP-1等，其中，MCP-1在AS的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。MCP-1能與單核細(xì)胞表面的 CC類(lèi)趨化因子受體2(CCR2)受體特異結(jié)合，使單核細(xì)胞經(jīng)損傷內(nèi)皮細(xì)胞間隙遷移入內(nèi)皮下，演變?yōu)榫奘杉?xì)胞，巨噬細(xì)胞通過(guò)清道夫受體不斷吞噬ox-LDL，啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)過(guò)程，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)構(gòu)成泡沫細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞增殖、移動(dòng)，最終形成脂紋和粥樣斑塊〔5，6〕抗MCP-1基因轉(zhuǎn)染不僅顯著抑制AS斑塊的起始和發(fā)生，而且還能限制AS斑塊的進(jìn)展，使不穩(wěn)定的AS斑塊轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的AS斑塊。Porreca等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，MCP-l不僅是趨化激活因子，對(duì)泡沫細(xì)胞形成極為重要，又能促進(jìn)人臍靜脈血管平滑肌(HUVSMC)增殖。本研究也發(fā)現(xiàn)ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC高表達(dá)MCP-1，也能促進(jìn)HUVEC增殖，從而促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展〔8〕。研究報(bào)道在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞和LDL注射胎牛血清，非諾貝特可抑制ox-LDL和LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，非諾貝特對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的人HUVEC MCP-1分泌有抑制作用，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，阻止AS發(fā)展〔9〕。

非諾貝特是一種人工合成的PPARα的激活物，是廣泛用于治療高甘油三酯的降脂藥物。PPARα激動(dòng)劑可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，也可通過(guò)不依賴(lài)降脂作用在不同階段阻礙AS的進(jìn)程。早期可改善動(dòng)脈血管的順應(yīng)性；其次可減少炎癥因子水平〔10〕。激活的PPARα可以降低炎癥因子的基因表達(dá)、減輕細(xì)胞間的黏附和遷移，改善內(nèi)皮細(xì)胞的功能〔11〕。PPARα的活化可改變血液中LDL與高密度脂蛋白(HDL)的比值，升高HDL、降低LDL，增加膽固醇的清除，從而減少泡沫細(xì)胞的形成，減緩AS〔12〕。PPARα的激活劑非諾貝特可以通過(guò)抑制活化蛋白-1、核轉(zhuǎn)錄因子-κB的活化，下調(diào)活性氧等途徑，減少M(fèi)CP-1的表達(dá)，從而減少血管壁單核細(xì)胞的聚集，降低炎癥反應(yīng)，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明非諾貝特通過(guò)激活PPARα，從而抑制HUVEC增殖及MCP-1分泌。

本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，非諾貝特呈劑量依賴(lài)性促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的人HUVEC分泌PPARα，抑制人HUVEC分泌MCP-1，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，揭示非諾貝特具有抗炎效應(yīng)，是保護(hù)內(nèi)皮功能的又一途徑。因此，臨床上應(yīng)用抗AS一方面發(fā)揮其高效的降脂作用，還可以行使其保護(hù)內(nèi)皮及AS的功能。

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〔2013-11-18修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)