辣椒素對類固醇糖尿病大鼠的影響及其作用機(jī)制

周曉燕應(yīng)長江1

(徐州醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，江蘇徐州221002)

摘要〔〕目的研究辣椒素對類固醇糖尿病(SDM)大鼠的影響及相關(guān)機(jī)制。方法SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(NC組)，SDM組和辣椒素組；檢測各組大鼠血糖，胰島素抵抗，血清中脂聯(lián)素和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的改變，胰島細(xì)胞凋亡率和胰腺組織細(xì)胞凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA變化。結(jié)果小劑量腹腔注射辣椒素明顯降低SDM大鼠血糖，抑制胰島素抵抗；增加血清脂聯(lián)素和CGRP的表達(dá)；下調(diào)SDM大鼠胰島細(xì)胞凋亡率和胰腺組織Caspase-3 mRNA的表達(dá)。結(jié)論辣椒素能改善SDM大鼠，與降低SDM大鼠血糖、抑制胰島素抵抗、增加血清脂聯(lián)素和CGRP的表達(dá)和抑制胰島細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕辣椒素；類固醇糖尿??；細(xì)胞凋亡；降鈣素相關(guān)蛋白；細(xì)胞凋亡蛋白酶-3

中圖分類號〔〕R587.2〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：徐州市科技項(xiàng)目(KC14SH094)

通訊作者：應(yīng)長江(1980-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事內(nèi)分泌并發(fā)癥研究。

1徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

第一作者：周曉燕(1982-)，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥研究。

類固醇糖尿病(SDM)是一種特殊類型的糖尿病，是指由于內(nèi)源性腎上腺糖皮質(zhì)激素(GC)分泌增多，或外源性應(yīng)用GC導(dǎo)致的繼發(fā)性糖尿病。超生理劑量的GC可以抗炎、抗過敏、抗毒素、免疫抑制，但GC的藥理特性是一把“雙刃劍”，在其發(fā)揮藥理作用的同時(shí)，也可產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)〔1〕。長期大劑量應(yīng)用GC，使血糖升高導(dǎo)致的繼發(fā)性糖尿病是臨床上最常見的不良反應(yīng)。辣椒素是從辣椒中提取出來的產(chǎn)生辣味的物質(zhì)，是香草酰胺衍生物，具有消炎鎮(zhèn)痛，擴(kuò)張血管，防治肥胖，保護(hù)胃黏膜以及抗腫瘤等作用〔2～4〕。研究顯示，辣椒素還能使胰島素分泌增加，降低血糖〔5〕，從而對糖尿病發(fā)揮一定程度的緩解和質(zhì)量作用。但是關(guān)于辣椒素對SDM是否具有治療和緩解作用，目前少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對SDM大鼠腹腔注射小劑量辣椒素，觀察其對SDM的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物和試劑清潔級雄性健康SD大鼠，體重160～180 g，8周齡，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；辣椒素購自Sigma公司；地塞米松由徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自中山金橋生物有限公司；TUNEL試劑盒購自Chemicon公司；PCR擴(kuò)增試劑盒購自上海天根生物有限公司；PCR引物購自上海生物工程有限公司。

1.2模型制備和實(shí)驗(yàn)分組40只大鼠隨機(jī)抽取8只為正常對照組(NC組)，其余32只造模為SDM大鼠：地塞米松腹腔注射(1 mg/kg，1次/d)連續(xù)3 w制備類固醇糖尿病大鼠模型，3 w后測空腹血糖(FPG)，大于13.8 mmol/L為標(biāo)準(zhǔn)篩選大鼠〔6〕19只，隨機(jī)分為類固醇糖尿病組(SDM組)8只和辣椒素組9只，死亡2只和血糖未達(dá)標(biāo)的11只大鼠剔除，造模期NC組注射等0.9%生理鹽水；SDM組和辣椒素組于繼續(xù)使用等量的地塞米松腹腔注射，其中辣椒素組于地塞米松前30 min腹腔注射辣椒素(0.5 mg/kg)，連續(xù)3 w，NC組注射等量0.9%生理鹽水。

1.3血糖監(jiān)測和標(biāo)本留取各組大鼠每日尾靜脈采血監(jiān)測血糖；3 w后，測量各組大鼠FPG和胰島素后，行心臟采血和快速分離胰腺手術(shù)；全血離心去上清，與-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?；胰腺組織一半于10%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)組織學(xué)計(jì)數(shù)制備石蠟切片，一半放入EP管-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4胰島素抵抗利用胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)來衡量胰島素抵抗水平，HOMA-IR=空腹胰島素(mIU/L)×FPG(mmol/L)/22.5〔7〕。

1.5血清脂聯(lián)素水平和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)均采用ELISA法，嚴(yán)格按照試劑盒的說明書操作，采用典型的競爭法酶聯(lián)免疫吸附測定大鼠血清脂聯(lián)素和CGRP，試劑盒及待測標(biāo)本放置室溫下平衡30 min后進(jìn)行。

1.6胰島細(xì)胞凋亡率采用TUNEL法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，中性樹脂封片。光鏡下觀察細(xì)胞體積縮小成團(tuán)或形成凋亡小體、胞核呈棕黃色的細(xì)胞即為陽性。用圖像分析儀對陽性細(xì)胞數(shù)行半定量分析，以高倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比作為分析指標(biāo)。

1.7血清胰腺組織細(xì)胞凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表達(dá)采用RT-PCR法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的步驟操作，配置50 μl的反應(yīng)體系，并設(shè)置反應(yīng)條件(表1)。電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析成像，各組目的片段分別于相應(yīng)的β-actin片段的相對灰度值比值作為Caspase-3 mRNA的相對量。

表1引物序列和RT-PCR反應(yīng)條件

基因引物序列片段長度(bp)退火溫度循環(huán)數(shù)Caspase-3正義5'-CTGGACTGCGGTATTGAG-3'10257℃32反義5'-GGGTGCGGTAGAGTAAGC-3'β-actin正義5'-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT-3'21755℃35反義5'-TTGATGTCACGCACGATTTC-3'

2結(jié)果

2.1辣椒素對SDM大鼠血糖和胰島素抵抗的影響SDM組FPG高于NC組(P<0.05)，辣椒素組FPG低于SDM組(P<0.05)；SDM組HOMA-IR高于NC組(P<0.05)，辣椒素組HOMA-IR低于SDM組(P<0.05)(表2)。

2.2辣椒素對SDM大鼠血清脂聯(lián)素和CGRP的影響SDM組血清脂聯(lián)素和CGRP低于NC組(P<0.05)，辣椒素組血清中脂聯(lián)素和CGRP高于SDM組(表2)。

2.3辣椒素對SDM大鼠胰島細(xì)胞凋亡率和Caspase-3 mRNA的影響SDM組胰島細(xì)胞凋亡率高于NC組(P<0.05)，辣椒素組胰島細(xì)胞凋亡率低于SDM組(P<0.05)(表2)；SDM組Caspase-3 mRNA表達(dá)(2.11±0.019)表達(dá)高于NC組(0.65±0.013)，辣椒素組Caspase-3 mRNA表達(dá)(1.61±0.016)低于SDM組(P<0.05)，但高于NC組(P<0.05)(圖1)。

組別nFPG(mmol/L)HOMA-IR脂聯(lián)素(ng/L)CGRP(ng/L)凋亡率(%)NC組85.16±2.233.98±0.760.98±0.27237.46±79.1215.64±6.41SDM組824.27±6.091)42.16±11.521)0.36±0.181)98.69±44.811)42.80±11.631)辣椒素組913.01±4.741)2)19.24±6.011)2)0.69±0.301)2)189.21±50.071)2)29.99±7.351)2)

與NC組比較：1)P<0.05；與SDM組比較：2)P<0.05

圖1　辣椒素對SDM大鼠胰腺組織Caspase-3 mRNA 表達(dá)的影響

3討論

SDM屬于繼發(fā)性糖尿病范疇，其發(fā)生機(jī)制主要是糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致肝糖原異生增加，骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取和糖原合成減少產(chǎn)生胰島素抵抗〔8〕。雖然這種激素所致的SDM發(fā)生率為10%～40%〔9〕，并且待其減量或者停藥后糖代謝異常多數(shù)能恢復(fù)正常，但是短暫的高血糖也會對人體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有害的影響。糖皮質(zhì)激素不僅可以使胰島細(xì)胞的胰島素分泌功能受損，也可以促進(jìn)凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，引起胰島細(xì)胞的凋亡〔10,11〕，但其分子機(jī)制還不是十分清楚。

以往對于SDM治療，首先采用飲食控制和加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)，必要時(shí)加用胰島素治療。但是單純飲食控制效果不好，有些病人(如腎臟疾病用糖皮質(zhì)激素治療)治療誘導(dǎo)期不適合運(yùn)動(dòng)，所以胰島素和降糖藥物治療常作為SDM首選。但對于既往無糖尿病的患者往往不易接受，而且全程必須監(jiān)測血糖，及時(shí)調(diào)整用量，以防患者發(fā)生低血糖，同時(shí)藥物存在的副作用(如低血糖)也給患者帶來很多不便。尋求能被患者接受，并且副作用小的藥物，已成為臨床上防治SDM一個(gè)研究熱點(diǎn)。

辣椒素可以通過結(jié)合機(jī)體內(nèi)辣椒素受體，促進(jìn)組織和血清中的CGRP釋放，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，引起神經(jīng)元及其纖維釋放多種神經(jīng)肽，對機(jī)體發(fā)揮保護(hù)作用。辣椒素能減低血糖，提高血漿胰島素水平和葡萄糖耐量〔12〕，同時(shí)，辣椒素通過上調(diào)組織和血清中CGRP的水平，抑制凋亡信號通路和下調(diào)相關(guān)蛋白，抑制血糖升高引起組織細(xì)胞的凋亡〔13〕。但是辣椒素降低血糖和緩解糖尿病并發(fā)癥的研究尚處于摸索階段，而且相關(guān)研究只限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，股靜脈給予小劑量辣椒素能降低SDM大鼠血糖和HOMA-IR，提高血清中脂聯(lián)素和CGRP的水平，下調(diào)胰島細(xì)胞Caspase-3 mRNA的表達(dá)，抑制胰島細(xì)胞凋亡，對SDM大鼠發(fā)揮保護(hù)作用。綜上，辣椒素通過降低SDM大鼠血糖和胰島素抵抗，增加SDM大鼠血清中脂聯(lián)素和CGRP的水平，下調(diào)胰島細(xì)胞的Caspase-3 mRNA表達(dá)而抑制胰島細(xì)胞凋亡，從而減輕大鼠SDM。但是對其效應(yīng)產(chǎn)生的具體機(jī)制和存在相關(guān)的信號通路，有待進(jìn)一步探討，以便為臨床上防治SDM提供一定的理論依據(jù)。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)