人牙髓干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及表面標(biāo)志鑒定

李偉曾常愛熊成玲湯洪胡紅梅1

(井岡山大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院口腔系，江西吉安343000)

摘要〔〕目的從人正畸牙牙髓提取牙髓干細(xì)胞，并對其表面標(biāo)志鑒定進(jìn)行研究。方法以經(jīng)典的酶聯(lián)合消化細(xì)胞原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞，并以流式分析儀檢測STRO-1 、CD34、CD45和CD146的鑒定方法對牙髓干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果倒置相差顯微鏡下觀察可見細(xì)胞呈回形狀或橢圓形，細(xì)胞較小，排列緊密，集落邊緣細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞大且較長，流式細(xì)胞術(shù)檢測牙髓干細(xì)胞表面標(biāo)志可見Stro-1，CD34、CD45和CD146為陰性。結(jié)論經(jīng)典的酶聯(lián)合消化細(xì)胞原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞取得了較好的效果，可以通過檢測STRO-1 、CD34、CD45和CD146的鑒定方法對牙髓干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

關(guān)鍵詞〔〕牙髓干細(xì)胞；體外培養(yǎng)；表面；標(biāo)志

中圖分類號〔〕R318.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：江西省科技廳資助項(xiàng)目(20122BBG70151-1)

通訊作者：胡紅梅(1976-)，女，碩士，副教授，主要從事干細(xì)胞的分化與增殖研究。

1井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院組胚教研室

第一作者：李偉(1972-)，男，碩士，副教授，主要從事牙體牙髓疾病的病因及治療研究。

臨床上由于牙髓感染導(dǎo)致的牙髓疾病是老年人健康所面臨的主要危害之一，摘除牙髓的牙齒由于缺乏營養(yǎng)供應(yīng)，容易發(fā)生牙根縱裂和牙冠劈裂。Gronthos等〔1〕分別從牙髓中分離出克隆單位，進(jìn)行了一系列體內(nèi)、體外研究手段，證實(shí)了牙髓中存在具有成體干細(xì)胞特性的牙髓干細(xì)胞，這個研究結(jié)果給口腔臨床醫(yī)生以極大的鼓舞，如果能夠在體內(nèi)牙齒根管中人工再生出牙髓結(jié)構(gòu)，并在牙齒根管中成活，將極大地提高患者的生活質(zhì)量。因此保留感染的牙髓組織并利用牙髓干細(xì)胞再生為修復(fù)性牙本質(zhì)，最大限度恢復(fù)老年人牙髓的生理狀態(tài)和功能已成為口腔臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬從人拔除的正畸牙牙髓提取牙髓干細(xì)胞，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為今后的牙髓干細(xì)胞相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，并為臨床治療老年患者牙髓炎提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1主要試劑與儀器地塞米松(Sigma，USA)，L-抗壞血酸(Amesco，USA)，SABC試劑盒(博士德試劑公司，武漢)，免疫組化試劑盒(DAKO，USA)，抗CD34、抗CD45和抗CD146多克隆抗體(博士德試劑公司，武漢)，DMEM高糖型培養(yǎng)基、胎牛血清、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、dispase(GIBCO，USA)。平底24孔、96孔塑料培養(yǎng)板、70 pm細(xì)胞篩網(wǎng)(Faleon，USA)，YJ-875型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)，倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus，Japan)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Nuaire,America)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板，高速離心機(jī)，細(xì)胞記數(shù)板，可見光分光光度計，酶聯(lián)免疫檢測儀。

1.2方法

1.2.1酶聯(lián)合消化法細(xì)胞原代培養(yǎng)收集完整拔除的健康人(12～25歲)正畸牙齒，牙齒表面75%乙醇、滅菌、0.01 mol/L滅菌PBS反復(fù)沖洗后在超凈工作臺中輕輕取出牙髓，用眼科剪剪根尖部牙髓組織約1 mm。立即用0.01 mol/L PBS液反復(fù)沖洗，然后剪碎組織成約1～3小塊，移入含0.3%的Ⅰ型膠原酶和0.4%的dipsase(1∶1)混合消化液的離心管中，37℃消化1 h，輕輕吹打離散單細(xì)胞團(tuán)塊，800 r/min離心5 min，0.01 mol/L PBS洗1遍。將細(xì)胞沉淀用含20%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)液重懸，以1×104～1×105ml密度液，以后每3 d換液l次，并收集對數(shù)生長期的培養(yǎng)上清備用。每日在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞生長達(dá)80%～90%匯合時，胰酶消化收集細(xì)胞并計數(shù)。

1.2.2牙髓干細(xì)胞鑒定取生長良好的克隆化培養(yǎng)細(xì)胞做細(xì)胞爬片。用ABC法按試劑盒說明進(jìn)行抗CD34、CD45、CD146免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DAB顯色，光鏡下觀察。牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)到 12 代，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行 STRO-1 的流式抗體表達(dá)水平的檢測。步驟簡述為：5×105個細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，PBS 清洗后用 STRO-1一抗 4℃孵育30 min，PBS 清洗2遍洗去殘余抗體，后再用異硫氰酸鹽熒光素(FITC)結(jié)合的 IgM 二抗孵育 4℃條件下孵育 30 min，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下觀察可見細(xì)胞生長狀況及基本形態(tài)：人原代牙髓干細(xì)胞第2天即可貼壁生長，部分出現(xiàn)集落性生長，集落生長細(xì)胞呈回形狀或橢圓形，細(xì)胞較小，排列緊密，集落邊緣細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞大且較長，集落間細(xì)胞較分散，細(xì)胞形態(tài)為梭形，類似成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞較大，第14天融合成單層細(xì)胞(圖1)。

2.2流式分析儀檢測流式抗體分析結(jié)果顯示，經(jīng)歷了 12 代的傳代培養(yǎng)，DPSC 中 STRO-1 陽性表達(dá)細(xì)胞為8.85%超過8%。流式細(xì)胞術(shù)檢測牙髓干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34(1.3%)、CD45(2.4%)和CD146(12.41%)，可見CD34、CD45和CD146為陰性，符合干細(xì)胞要求，證明所培養(yǎng)細(xì)胞為成人牙髓干細(xì)胞。

圖1　原代培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)(×100)

3討論

牙髓干細(xì)胞是位于牙髓組織的一種成體干細(xì)胞〔2〕。同其他組織一樣，牙髓組織也具有修復(fù)與再生的能力。牙髓干細(xì)胞的成功獲得表明在牙髓組織中同樣存在保持未分化狀態(tài)的成體干細(xì)胞，為牙齒發(fā)育研究及牙齒的再生奠定了基礎(chǔ)。其后許多學(xué)者利用大鼠和家兔進(jìn)行了系列體內(nèi)、體外研究，均成功形成反應(yīng)性牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)〔3〕，并進(jìn)一步證實(shí)了牙髓中存在具有成體干細(xì)胞特性的牙髓干細(xì)胞〔4〕。目前牙髓干細(xì)胞的研究還處在起步階段，大多數(shù)的研究對牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定并沒有一個權(quán)威的結(jié)論，本次實(shí)驗(yàn)以經(jīng)典的酶聯(lián)合消化法細(xì)胞原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞取得了較好的效果，鏡下觀察細(xì)胞主要為胞體較大的成纖維細(xì)胞和少量小而不規(guī)則形的細(xì)胞，提示所培養(yǎng)的細(xì)胞可能是包含牙髓干細(xì)胞在內(nèi)的混合細(xì)胞群。并以檢測STRO-1 、CD34、CD45和CD146的鑒定方法對牙髓干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，可見CD34、CD45為陰性，符合干細(xì)胞要求，從 STRO-1 的流式抗體檢測結(jié)果，我們也能看出來在傳代第 12 代時，被人牙胚條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的DPSC仍然含有超過7%的STRO-1陽性細(xì)胞，人的牙胚條件培養(yǎng)都能較好的保持 DPSC 的干細(xì)胞特性。

牙髓干細(xì)胞的研究還處在早期摸索階段，而且還由于缺少特異性標(biāo)記，目前無法獲得精確的定性、定位和純化，因此在體外培養(yǎng)還存在易變性、很難進(jìn)行大量的擴(kuò)增等問題，所有這些限制了牙髓干細(xì)胞的發(fā)展。但是牙髓干細(xì)胞的臨床應(yīng)用相信有一個廣闊的前景，應(yīng)用在牙髓再生和臨床保存活髓治療價值方面將有一個巨大的變革。

4參考文獻(xiàn)

1Gronthos S,Mankani M,Brahim J,etal.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs) in vitro and in vivo〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2000;97(25):13625-30.

2Kara ZE,Demircan PC,Saam O,etal,Human dental pulp stem cells demonstrate better neural and epithelial stem cell properties than bone marrow-derived mesenchymal stem cells〔J〕.Histochem Cell Biol J,2011;136(4):455-73.

3賀慧霞,金巖,史俊南，等.人牙髓干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定〔J〕.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2004;20(9):515-7.

4包柳郁,金巖,史俊南,等.人牙源性間充質(zhì)細(xì)胞體內(nèi)立體培養(yǎng)模型的建立構(gòu)建組織工程化牙本質(zhì)和牙髓組織〔J〕.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2004;14(11):603-6.

〔2014-03-22修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)