人參莖葉總皂苷對D-半乳糖致衰老小鼠免疫功能的影響

劉佳張敬敬李明陽石高星曾志能魏珊珊

(長沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，湖南長沙410219)

摘要〔〕目的探討人參莖葉總皂苷(GSLS)對D-半乳糖致衰老小鼠免疫功能的影響。方法GSLS以低、中、高劑量5、20、80 mg·kg-1·d-1給小鼠灌胃，模型組和空白組以生理鹽水灌胃；同時，除空白組外，其他組每天頸背部皮下注射D-半乳糖制備亞急性衰老模型；連續(xù)灌胃和注射42 d。計(jì)算小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，通過淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)衡量淋巴細(xì)胞增殖能力，測定巨噬細(xì)胞吞噬能力。結(jié)果模型組與空白組比較，巨噬細(xì)胞吞噬率下降(P<0.01)，其他各項(xiàng)免疫力檢測值差異不顯著；與模型組比較，GSLS灌胃中、低劑量組胸腺指數(shù)上升(P<0.05)，中劑量組的巨噬細(xì)胞吞噬率明顯增大(P<0.01)，中、低劑量組巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著上升(P<0.01)，其他免疫指標(biāo)變化不顯著。結(jié)論GSLS可通過增加胸腺比重、強(qiáng)化巨噬細(xì)胞功能從而改善D-半乳糖致衰老模型小鼠的免疫力。

關(guān)鍵詞〔〕人參莖葉總皂苷；免疫力；衰老；D-半乳糖

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(13C1131)

通訊作者：張敬敬(1977-)，女，碩士，講師，主要從事衰老的細(xì)胞生物特性研究。

第一作者：劉佳(1979-)，女，碩士，講師，主要從事抗衰老的生物機(jī)制研究。

近年來，國內(nèi)學(xué)者對人參有效成分進(jìn)行了科學(xué)研究，確認(rèn)了人參具有抗腫瘤、抗輻射、抑制中樞疲勞、改善微循環(huán)等作用〔1〕。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)人參莖葉總皂苷(GSLS)在一定程度上具有抗衰老作用。免疫功能減退導(dǎo)致機(jī)體老化是衰老的重要學(xué)說，即高等動物隨著增齡，免疫器官功能會逐漸下降，細(xì)胞功能失調(diào)、抵抗力降低因而容易受到不利因素侵?jǐn)_，趨向于老化和衰弱〔2〕。本課題探討GSLS對衰老小鼠的免疫力的影響。

1材料與方法

1.1動物、試劑及儀器SPF級昆明小鼠，雄性，體重(22±2)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，批號43004700000890，長沙醫(yī)學(xué)院湖南省重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科標(biāo)準(zhǔn)動物室飼養(yǎng)。GSLS，含量≥80%UV，購自吉林省宏久生物科技公司。D-半乳糖購自Genview公司。植物血凝素(PHA)購自上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。20%雞紅細(xì)胞懸液，自備。生物顯微鏡及數(shù)碼成像設(shè)備(德國Motic公司)。

1.2方法40只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為五組：空白組，模型組，GSLS低、中、高劑量組(5、20、80 mg·kg-1·d-1)，每組8只，自由攝食和飲水。每天稱重，實(shí)驗(yàn)組按體重灌胃GSLS，空白組和模型組按照5 ml·kg-1·d-1生理鹽水灌胃。除空白組外，其他組頸背部皮下注射D-半乳糖500 mg·kg-1·d-1制備亞急性衰老小鼠模型，空白組注射同體積生理鹽水，連續(xù)灌胃和注射42 d。

1.3胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)于末次給藥后2 h精確稱量小鼠體重，小鼠摘眼球取血而死，冰上分離胸腺和脾臟，在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗，除去血污，吸水紙吸干后稱重。

1.4淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(體內(nèi)法)〔3〕給藥的第39～41天，各組小鼠每只后肢外側(cè)肌肉處注射植物血凝素0.4 mg。末次給藥后2 h摘眼球取血，以生理鹽水稀釋4倍后制備薄血涂片。自然晾干后用甲醇固定1～3 min，待其自然揮發(fā)后以吉姆薩染液染色30 min，沖洗去多余染液后晾干觀察。油鏡下觀察100個淋巴細(xì)胞，計(jì)算淋巴母細(xì)胞(過渡型細(xì)胞計(jì)在內(nèi))所占百分比，即淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。

1.5腹腔巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)(半體內(nèi)法)〔4〕給藥的第40、41天，以6%淀粉肉湯腹腔注射。末次給藥后1.5 h腹腔注射1 ml 20%雞紅細(xì)胞懸液、揉勻，30 min后取血處死小鼠。消毒腹部，剪開腹壁皮膚，注射2 ml生理鹽水到腹腔中，揉勻后用無針頭注射器吸取腹腔液，約每500 μl滴于一塊載玻片上，每只小鼠備兩塊，置37℃水浴箱中黏附30 min，取出后用預(yù)熱的生理鹽水沖洗未被吞噬的雞紅細(xì)胞，晾干后同上甲醇固定、吉姆薩染液染色后觀察。油鏡下計(jì)數(shù)100個巨噬細(xì)胞，按公式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD法。

2結(jié)果

2.1GSLS對衰老小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響經(jīng)過不同處置，各組小鼠的胸腺指數(shù)存在區(qū)別(F=5.623，P=0.001)，其中GSLS低劑量組和中劑量組的胸腺指數(shù)高于模型組(P=0.027、0.033)，其他各組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組小鼠的脾臟指數(shù)無顯著差別(F=1.170，P=0.341)。見表1。

2.2GSLS對衰老小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響空白組、模型組及GSLS各劑量組比較，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率無顯著差別(F=0.895，P=0.477)。見表2，圖1。

2.3GSLS對衰老小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響各組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)存在顯著差異(F=11.506、6.193，P<0.01)。其中，模型組巨噬細(xì)胞吞噬率顯著低于空白組(P=0.000)，而GSLS中劑量組小鼠比模型組有明顯提高(P=0.001)。同時，中、低劑量組吞噬指數(shù)也顯著高于模型組(P=0.001、0.008)，表明GSLS對衰老小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力有促進(jìn)作用。見表2。

表1GSLS對衰老小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

組別胸腺指數(shù)脾臟指數(shù)空白組1.01±0.163.69±0.54模型組1.00±0.133.36±0.53GSLS低劑量組1.27±0.2631)3.34±0.33GSLS中劑量組1.25±0.351)3.19±0.39GSLS高劑量組0.82±1.683.26±0.64

與模型組比較：1)P<0.05

組別T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(%)巨噬細(xì)胞吞噬率(%)巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)空白組55.13±15.5492.75±6.963.39±1.46模型組50.06±12.9941.38±16.911)2.36±0.95GSLS低劑量組62.38±10.2143.12±21.775.23±1.492)GSLS中劑量組53.75±12.6276.63±15.822)4.54±2.342)GSLS高劑量組56.25±13.3448.25±27.962.08±1.06

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

圖1　各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞(吉姆薩染色，×1 000)

3討論

免疫器官的臟器指數(shù)是衡量機(jī)體免疫能力的基本指標(biāo)。其中，胸腺是T淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化、篩選和成熟的場所〔5〕。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕鹛谴x紊亂、氧化應(yīng)激從而模擬衰老〔6〕，而對免疫系統(tǒng)影響不顯著，GSLS可能通過胸腺來優(yōu)化T淋巴細(xì)胞質(zhì)量。淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)是用于檢測其受刺激后增殖能力的，同時實(shí)驗(yàn)中卻發(fā)現(xiàn)，GSLS對淋巴細(xì)胞向淋巴母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方面并無促進(jìn)作用。綜合權(quán)衡，GSLS對特異性淋巴細(xì)胞的作用在于促“質(zhì)”而非增“量”。脾臟指數(shù)提示B淋巴細(xì)胞成熟、體液免疫等方面可能并未因GSLS而發(fā)生改變。巨噬細(xì)胞是具有多種功能的免疫細(xì)胞，作為體內(nèi)的“清道夫”，它們會非特異性的去除體內(nèi)那些損傷死去的細(xì)胞以及其他有害成分，也可以“呈遞”抗原，啟動一系列特異性免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中可以看到，中低劑量給予GSLS可以提高巨噬細(xì)胞的反應(yīng)靈敏度——吞噬比率增高，也可以增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬能力——吞噬指數(shù)增大，在非特異免疫方面起到良性作用。這些方面的免疫力提升可能是GSLS能抗機(jī)體衰老的重要機(jī)制之一。另外，本課題GSLS存在低劑量顯效、長時間加高劑量抑制的雙向調(diào)節(jié)作用，因此，“久服輕身延年”的服藥方式尚值得商榷。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-06-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)