絲膠對(duì)Fas介導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

劉東波魏萌張艷喬躍兵陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000)

摘要〔〕目的觀察絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠血糖、胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)、胰島細(xì)胞中胰島素及胰島β細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)死亡受體(Fas)表達(dá)的作用。方法48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病模型組、二甲雙胍組、絲膠治療組，每組12只。采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病動(dòng)物模型,成模后，絲膠治療組和二甲雙胍組大鼠分別給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)和二甲雙胍(55.33 mg·kg-1·d-1)灌胃。給藥4 w后禁食12 h，麻醉后取血，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠空腹血糖(FPG)；常規(guī)HE染色普通光鏡下觀察胰島的形態(tài)結(jié)構(gòu)和免疫組織化學(xué)染色法觀察胰島細(xì)胞中胰島素表達(dá)情況；免疫組織化學(xué)染色法觀察胰島β細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)Fas蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果①與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠FPG明顯升高(P<0.01);與模型組比較，絲膠治療組和二甲雙胍組FPG明顯降低(P<0.01)；②與正常對(duì)照組相比，模型組胰島萎縮、輪廓欠圓潤(rùn)、邊緣不規(guī)則，胰島細(xì)胞數(shù)量減少且分布稀疏而不均勻，胰島素表達(dá)水平下降(P<0.05)；與模型組比較，絲膠治療組和二甲雙胍組大鼠胰島細(xì)胞數(shù)量增多，分布也比較致密，胰島素表達(dá)水平上升(P<0.05)；③與正常對(duì)照組相比，模型組Fas蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，與模型組比較，絲膠治療組和二甲雙胍組Fas蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。以上指標(biāo)絲膠治療組和二甲雙胍組比較均無(wú)明顯差異(P>0.05)。結(jié)論絲膠對(duì)2型糖尿病具有治療作用，其機(jī)制可能與抑制Fas介導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕2型糖尿??；絲膠；胰島素；Fas

中圖分類號(hào)〔〕R587〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：河北省自然科學(xué)

通訊作者：?jiǎn)誊S兵(1965-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)分泌方面研究。

第一作者：劉東波(1986-)，男，碩士，主要從事內(nèi)分泌方面研究。

目前全球有糖尿病患者2.85億，中國(guó)糖尿病人群數(shù)量可占到全球的1/3，而其中90%以上為2型糖尿病〔1〕。2型糖尿病是遺傳和環(huán)境因素共同作用的多基因復(fù)雜性疾病，其病理機(jī)制為β細(xì)胞功能受損和胰島素抵抗，二者在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中到底誰(shuí)是首要原因尚存在異議，最近的研究開(kāi)始重視胰島β細(xì)胞功能受損在糖尿病病程發(fā)展中的作用〔2〕。胰島β細(xì)胞的數(shù)量決定分泌胰島素的多少，β細(xì)胞凋亡增加可造成β細(xì)胞數(shù)量減少，最終導(dǎo)致胰島素分泌不足和糖尿病〔3,4〕。最近的一項(xiàng)大規(guī)模尸檢發(fā)現(xiàn)，糖耐量受損和2型糖尿病患者均存在β細(xì)胞數(shù)量的明顯減少，2型糖尿病患者更為嚴(yán)重〔5〕。前期研究證明絲膠可通過(guò)上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)和下調(diào)促凋亡基因Bax表達(dá)調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞凋亡、增殖的平衡〔6〕。本研究探討絲膠對(duì)糖尿病大鼠血糖、胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)、胰島細(xì)胞中胰島素和胰島β細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Fas表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1藥物和試劑絲膠由彩色蠶繭經(jīng)浸泡、水煎、過(guò)濾、濃縮而成。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma公司，用pH4.4的枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液配成2%的溶液；鹽酸二甲雙胍，遼寧一成藥業(yè)有限公司，臨用時(shí)研成細(xì)末用蒸餾水配成溶液；血糖檢測(cè)試劑盒，保定長(zhǎng)城臨床試劑有限公司；胰島素小鼠抗大鼠單克隆抗體、Fas兔抗鼠多克隆抗體、免疫組化試劑盒，均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及處理清潔級(jí)雄性SD大鼠48只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：712024。大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病模型組、二甲雙胍組、絲膠治療組，每組12只。采用小劑量鏈脲佐菌素(STZ，25 mg/kg)連續(xù)腹腔注射，連續(xù)3 d，1 w后以血糖為≥16.7 mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)，待成模后，絲膠治療組和二甲雙胍組分別給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)和二甲雙胍(55.33 mg·kg-1·d-1)灌胃，連續(xù)35 d；正常對(duì)照組和模型組不作處理。

1.3檢測(cè)血糖各組大鼠禁食12 h，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血，京立LD4-2A離心機(jī)3 000 r/min，離心20 min，收集血清，使用日本日立公司的Boehringer Mannhein/Hitachi全自動(dòng)臨床生化分析儀采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖。

1.4胰島的形態(tài)學(xué)觀察大鼠取血后斷頭處死，取胰腺入Bouins液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5 μm。常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化并攝片。免疫組化染色及定量分析：SP免疫組化染色法觀察胰島細(xì)胞中胰島素和胰島β細(xì)胞Fas蛋白的表達(dá)，一抗稀釋濃度胰島素為1∶150，F(xiàn)as為1∶100，陰性對(duì)照加等量PBS，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。定量分析：使用Image-pro plus 6.0圖像分析處理軟件，在10×20倍顯微鏡下隨機(jī)選取胰島作為觀察視野，計(jì)算陽(yáng)性產(chǎn)物面積占胰島面積的比值；每組隨機(jī)選取5只大鼠，每只大鼠任選5張切片，每張切片選取3個(gè)胰島，取平均值。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血糖比較與正常對(duì)照組相比，模型組血糖顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，二甲雙胍和絲膠治療組血糖明顯降低(P<0.01)；二甲雙胍和絲膠治療組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

組別血糖胰島素β細(xì)胞正常對(duì)照組10.83±2.030.785±0.0630.150±0.016模型組二甲雙胍組29.45±4.821)13.18±2.303)0.524±0.0862)0.684±0.0534)0.515±0.0422)0.318±0.0234)絲膠治療組13.20±4.093)0.703±0.0344)0.359±0.0344)

與正常對(duì)照組比較:1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.01，4)P<0.05

2.2各組大鼠胰島的形態(tài)結(jié)構(gòu)正常對(duì)照組胰島島形豐滿，輪廓清晰，到細(xì)胞分布緊密而均勻；模型組胰島萎縮，輪廓欠圓潤(rùn)，邊緣不規(guī)則，胰島細(xì)胞數(shù)量減少且分布稀疏而不均勻；絲膠治療組和二甲雙胍組胰島細(xì)胞數(shù)量均增多，分布也比較致密，絲膠治療組與二甲雙胍組胰島形態(tài)變化差異不大。見(jiàn)圖1。

圖1　各組胰腺組織HE染色(×200)

2.3各組大鼠胰島細(xì)胞中胰島素的表達(dá)情況 光鏡下正常對(duì)照組大鼠胰島結(jié)構(gòu)完整，比較飽滿，邊界清晰，胰島素陽(yáng)性顆粒經(jīng)染色后為棕色,在胰島中廣泛分布；模型組大鼠胰島縮小，邊界不清，胰島素表達(dá)水平下降(P<0.05)；二甲雙胍組和絲膠治療組大鼠胰島增大，邊界較清晰，胰島素表達(dá)較模型組升高(P<0.05)，二者之間比較無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖2。

圖2　各組胰島細(xì)胞中胰島素表達(dá)情況(DAB，×200)

2.4各組大鼠胰島β細(xì)胞Fas蛋白的表達(dá)Fas蛋白免疫陽(yáng)性產(chǎn)物為棕色，位于細(xì)胞質(zhì)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要為胰島胰島β細(xì)胞。與正常對(duì)照組相比，模型組Fas表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，絲膠治療組和二甲雙胍組Fas表達(dá)減少(P<0.05)；絲膠治療組和二甲雙胍組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3，表1。

圖3　各組胰島β細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)Fas蛋白的表達(dá)(DAB，×200)

3討論

胰島β細(xì)胞凋亡造成的胰島數(shù)量不足和胰島功能受損在糖尿病的病程進(jìn)展具有重要作用。如何保護(hù)殘存的胰島β細(xì)胞和減少凋亡來(lái)延緩糖尿病的進(jìn)展，成為目前糖尿病研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)〔7～9〕。

胰島β細(xì)胞凋亡是一個(gè)非常復(fù)雜的生理和病理過(guò)程，是由自身內(nèi)部機(jī)制調(diào)節(jié)的主動(dòng)性、特定程序性的細(xì)胞自發(fā)性死亡方式。調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號(hào)導(dǎo)通路主要有3條：死亡受體通路、線粒體通路及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路〔10〕。最近研究顯示，F(xiàn)as所引起的胰島β細(xì)胞凋亡是糖尿病的發(fā)病因素，屬于死亡受體途徑〔11,12〕。Fas與死亡受體配體(FasL)結(jié)合后傳遞細(xì)胞程序化死亡信息，產(chǎn)生有活性的半胱天冬蛋白酶(Caspase)-8，激發(fā)一系列Caspase下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔13〕。

本研究結(jié)果表明絲膠可通過(guò)降低血糖，下調(diào)凋亡蛋白Fas的表達(dá)，減少胰島細(xì)胞的凋亡，從而增加胰島細(xì)胞胰島素的表

達(dá)，使得相應(yīng)的胰島細(xì)胞數(shù)量增加，在一定程度上恢復(fù)胰島的功能，因此絲膠對(duì)糖尿病具有一定的治療作用。絲膠為天然高分子水溶性蛋白，由18種氨基酸組成，約占繭絲的30%，在繅絲和精煉時(shí)大部分被丟棄。絲膠具有低毒或無(wú)毒，副作用比較少，可明顯促進(jìn)胰島再生、改善胰島素抵抗且來(lái)源比較廣泛。本研究進(jìn)一步探索了絲膠保護(hù)胰島細(xì)胞凋亡的內(nèi)在機(jī)制，為充分利用絲膠提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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〔2014-06-27修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)