綠茶提取物對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠腓腸肌游離脂肪酸含量及激素敏感性脂肪酶蛋白表達(dá)的影響

李敏華唐健雷麗1

(廣西師范大學(xué)體育學(xué)院，廣西桂林541004)

摘要〔〕目的研究綠茶提取物在運(yùn)動(dòng)中對(duì)機(jī)體肌肉組織中能量代謝的作用。方法SD雄性大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為安靜對(duì)照組，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組，低劑量綠茶提取物組(TPEL)，中劑量綠茶提取物組(TPEM)，高劑量綠茶提取物組(TPEH)。每天在運(yùn)動(dòng)前30 min灌胃1次，連續(xù)灌胃6 w，6 d/w，低、中、高劑量組分別為5,10,15 g·kg-1·d-1，對(duì)照組灌胃等量生理鹽水。6 w力竭訓(xùn)練結(jié)束后，宰殺大鼠。根據(jù)試劑盒的方法測(cè)定大鼠腓腸肌游離脂肪酸(FFA)含量和Western印跡法測(cè)定大鼠腓腸肌組織激素敏感性脂肪酶(HSL)蛋白表達(dá)。結(jié)果力竭游泳訓(xùn)練導(dǎo)致大鼠腓腸肌FFA含量均顯著升高，綠茶提取物組大鼠高于安靜對(duì)照組(P<0.01)和運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(P<0.05)。力竭游泳運(yùn)動(dòng)和綠茶提取物各組大鼠腓腸肌HSL 蛋白表達(dá)水平升高綠茶提取物組大鼠高于安靜對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(P<0.01)，TPEM、TPEH組與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)。結(jié)論綠茶提取物能夠促進(jìn)肌內(nèi)脂肪酸合成為運(yùn)動(dòng)供能并調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。

關(guān)鍵詞〔〕綠茶提取物；力竭運(yùn)動(dòng)；游離脂肪酸；激素敏感性脂肪酶

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕G804.2〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(11107022-3);廣西醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)人才小高地項(xiàng)目(1109)

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科

第一作者：李敏華(1977-)，女，碩士，講師，主要從事運(yùn)動(dòng)生理學(xué)與生物化學(xué)研究。

綠茶提取物(TPE)由茶多酚、咖啡堿、芳香油、礦物質(zhì)、色素、氨基酸、類(lèi)脂、維生素等眾多成分組成。在這些成分中，茶多酚、咖啡堿、芳香油對(duì)茶葉的質(zhì)量與飲茶的功效關(guān)系最為密切〔1，2〕。有研究表明TPE是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑具有抗癌、降血脂、抗病毒、減肥、保護(hù)心肌和增強(qiáng)免疫功能等功效〔3～5〕。在運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域，屈萍等〔6〕研究認(rèn)為T(mén)PE能有效抑制和修復(fù)無(wú)氧運(yùn)動(dòng)造成的骨骼肌損傷，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)性疲勞的消除。本研究探討運(yùn)動(dòng)前補(bǔ)充TPE對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠腓腸肌游離脂肪酸(FFA)含量及激素敏感性脂肪酶(HSL)蛋白表達(dá)變化的影響。

1材料與方法

1.1動(dòng)物SD雄性健康大鼠50只，體重(200±10)g，購(gòu)自桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF 級(jí)，許可證號(hào):SCXK(桂)2007-0001。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度保持在(23 ± 3)℃，相對(duì)濕度55%～75%，光照時(shí)間隨自然變化。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均以基礎(chǔ)飼料(桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供)和蒸餾水常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。

1.2藥物及試劑TPE(桂林興達(dá)制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)20121127，純度≥60%)，F(xiàn)FA試劑盒(美國(guó)Phoenix Biotech 公司，批號(hào)E0612)，HSL、β-actin 抗體為鼠單抗(一抗體，美國(guó) Santa Cruz公司，批號(hào)C20117)，羊抗鼠IgG(二抗體，北京中杉金橋生物公司，批號(hào)2012323)，NC膜(美國(guó)Millipore公司，批號(hào)A910347)，Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(香港昊柏生物科技有限公司，批號(hào)20120301)。

1.3儀器Bio-Rad電泳儀、垂直電泳槽及半干轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)伯樂(lè)儀器有限公司)，BioTek多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；3k15高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Carestream公司)；大型冷凍空氣恒溫?fù)u床(DHZ-032R,上海博彩科技公司)。

1.4動(dòng)物分組為使實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)新環(huán)境，首先將購(gòu)回的大鼠分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)6 d后隨機(jī)分組，每組10只，分別為安靜對(duì)照組，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組，低、中、高劑量組(TPEL、TPEM、TPEH組)。大鼠在訓(xùn)練前30 min灌胃不同濃度TPE溶液，劑量分別為5,10,15 g·kg-1·d-1，灌胃體積為5 ml/kg，對(duì)照組灌胃等量生理鹽水，各組大鼠連續(xù)灌胃6 w，1次/d，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.5方法各訓(xùn)練組大鼠均采用游泳運(yùn)動(dòng)。動(dòng)物游泳池的規(guī)格為長(zhǎng)100 cm寬50 cm高60 cm的玻璃泳槽，水深50 cm，水溫(31±2)℃。為防止大鼠在水面漂浮不動(dòng)，特在游泳箱底部放置佳寶“AP1500”型水泵形成流動(dòng)水。訓(xùn)練共6 w，大鼠于每天上午8：00進(jìn)行負(fù)重游泳訓(xùn)練(大鼠每只尾部負(fù)自身體重3%的鉛墜進(jìn)行游泳〔7〕)，運(yùn)動(dòng)至力竭，1次/d，6 d/w，每次游泳訓(xùn)練至力竭。對(duì)于短時(shí)間內(nèi)力竭的大鼠，撈出休息5 min后，再進(jìn)行游泳訓(xùn)練，使訓(xùn)練時(shí)間不少于60 min。力竭標(biāo)準(zhǔn)：大鼠頭部沉入水下超過(guò)10 s仍不再返回水面；大鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)消失，在水中不定向亂竄，未達(dá)到10 s 亦定為力竭。

1.6樣本采集6 w力竭運(yùn)動(dòng)結(jié)束后取材，取材前大鼠禁食12 h以上，訓(xùn)練組停訓(xùn)24 h。用20%烏拉坦溶液(2.5 ml/kg)腹腔注射麻醉，冰上迅速解剖取其大鼠右腿腓腸肌組織，4℃生理鹽水清洗，剪成小塊裝入凍存管中，先置液氮中，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中待測(cè)。

1.7FFA含量指標(biāo)的測(cè)試準(zhǔn)確稱取0.20 g腓腸肌組織待測(cè)樣品，加入生理鹽水，在低溫條件下仔細(xì)研磨，制成體積比為10%的勻漿液，以4 000 r/ min 轉(zhuǎn)速離心15 min(0～4℃) 后取上清液于冰浴中測(cè)定FFA的含量，測(cè)定方法嚴(yán)格按試劑盒提供的步驟進(jìn)行。

1.8Western印跡法測(cè)定大鼠腓腸肌組織HSL蛋白表達(dá)制備樣品蛋白：取腓腸肌標(biāo)本以生理鹽水充分沖洗后，把組織剪切成細(xì)小的碎片，裂解液裂解，冰上勻漿，至充分裂解。離心，取上清-20℃保存。①電泳：安裝電泳槽，配制15% SDS-PAGE分離膠，灌膠，封膠。配制5%的濃縮膠，灌膠，上梳，填滿空隙，放置30 min，去離子水洗滌。放入電泳槽，倒入電泳緩沖液，加樣品，樣品在沸水中煮沸，每井10 μl。80 V 20 min后調(diào)至120 V電泳1 h左右，至溴酚藍(lán)跑出膠板。染色4 h，脫色5 h。②免疫印跡：將凝膠移至盛有水的平皿中，浸洗3次，轉(zhuǎn)移至電泳緩沖液中，室溫浸泡3 h。準(zhǔn)備N(xiāo)C膜，濾紙，NC光面向上，凝膠置于其上，放入電轉(zhuǎn)移槽。14 V，100 mA，轉(zhuǎn)印2 h。封閉過(guò)夜。NC置于單克隆抗體HSL(1∶300)液中，緩搖2 h。 PBS/T洗膜3次，每次15 min，將NC置于1∶2 000稀釋的羊抗鼠IgG，室溫緩搖2 h。PBS/T洗膜3次，每次10 min，將NC置于DAB底物中反應(yīng)著色拍照。③結(jié)果半定量：以β-actin代替鼠抗HSL重復(fù)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，在底片上得到內(nèi)參β-actin的條帶。圖像分析系統(tǒng)掃描條帶灰度值，用底片上鼠抗HSL條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin條帶的灰度值的比值半定量分析的HSL蛋白表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1力竭運(yùn)動(dòng)大鼠腓腸肌FFA含量的變化與安靜對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組和TPE組均引起大鼠腓腸肌FFA含量均極顯著升高(P<0.01)，補(bǔ)充不同劑量的TPE組大鼠較運(yùn)動(dòng)對(duì)照組大鼠腓腸肌FFA含量仍有顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組別FFA含量(μmol/L)HSL/β-actin安靜對(duì)照組342.63±40.050.93±0.14運(yùn)動(dòng)對(duì)照組626.41±38.122)3)1.62±0.101)TPEL組658.53±41.022)3)1.73±0.131)TPEM組659.62±39.232)3)2.19±0.172)4)TPEH組662.60±38.172)3)2.36±0.122)4)

2.2力竭運(yùn)動(dòng)大鼠腓腸肌HSL蛋白表達(dá)HSL與β-actin 條帶的灰度比較，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)對(duì)照組和補(bǔ)充不同劑量的TPE組大鼠腓腸肌HSL 蛋白表達(dá)高于安靜對(duì)照組(P<0.05)；補(bǔ)充不同劑量的TPE組大鼠腓腸肌HSL 蛋白表達(dá)較運(yùn)動(dòng)對(duì)照組高，其中在TPEM、TPEH組大鼠腓腸肌HSL 蛋白表達(dá)與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組比較有極顯著差異(P<0.01)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1　各組大鼠HSL蛋白表達(dá)

3討論

FFA是機(jī)體內(nèi)的重要能量來(lái)源和重要的信號(hào)分子〔8〕。在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，骨骼肌FFA的主要來(lái)源于肌內(nèi)甘油三酯(TG)的水解和攝取血清FFA，并且肌內(nèi)脂肪酸的氧化隨血清FFA的升高而隨之加快。張雪琳等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后血清FFA水平升高，導(dǎo)致骨骼肌中解耦聯(lián)蛋白的表達(dá)上調(diào)。孫建波〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)前補(bǔ)充何首烏復(fù)方可降低FFA含量。魏秀芳等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充山楂葉總黃酮自乳化顆粒能夠降低脂肪肝大鼠FFA含量，從而起到治療大鼠脂肪肝的作用。劉海英等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，服用槲皮素后大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)FA含量顯著提高，說(shuō)明補(bǔ)充槲皮素能夠促進(jìn)大鼠脂肪動(dòng)員水解，從而提高大鼠的運(yùn)動(dòng)能力。本研究提示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠有利于脂肪動(dòng)員水解，而補(bǔ)充不同劑量的TPE后大鼠腓腸肌FFA含量亦有顯著性升高，提示補(bǔ)充TPE后可能有助于大鼠體內(nèi)糖儲(chǔ)備的提高，影響不同狀態(tài)下的脂肪代謝，促進(jìn)脂肪利用的作用。

激素敏感性脂肪酶是最早發(fā)現(xiàn)和克隆的脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分解酶，是脂肪組織和肌肉組織肌內(nèi)TG水解的關(guān)鍵限速酶，能水解TG、甘油二酯、膽固醇酯和其他脂質(zhì)及一些水溶性底物，產(chǎn)生Glycerol和FFA。在運(yùn)動(dòng)中研究HSL基因表達(dá)量來(lái)探討運(yùn)動(dòng)員脂肪水解具有重要的意義。Huijsman等〔13〕研究表明，急性運(yùn)動(dòng)引起工作肌HSL mRNA表達(dá)顯著上升。Helge等〔14〕對(duì)經(jīng)常運(yùn)動(dòng)的婦女進(jìn)行兩周高強(qiáng)度有氧間歇運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練發(fā)現(xiàn)，訓(xùn)練后HSL蛋白含量有上升的趨勢(shì)。Enevoldsen等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)18 w游泳訓(xùn)練大鼠腓腸肌脂肪組織HSL酶活性比安靜組升高。謝偉華等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)補(bǔ)充不同劑量的山楂黃酮能夠上調(diào)肌肉組織中HSL蛋白表達(dá)。高斌等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充普洱茶茶褐素可顯著增強(qiáng)大鼠肝臟和附睪脂肪組織HSL 活性及其mRNA 的表達(dá)。本研究顯示，力竭游泳訓(xùn)練后大鼠腓腸肌HSL 蛋白表達(dá)高于安靜對(duì)照組，這與相關(guān)研究結(jié)果相一致〔13～15〕，提示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠引起肌肉組織的分解，從而加速體內(nèi)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。TPE能夠促進(jìn)肌內(nèi)脂肪酸合成同時(shí)又促進(jìn)其分解代謝，但其促進(jìn)分解的作用更強(qiáng)，提示TPE在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝方面具有積極的意義。

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〔2014-06-18修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)