白藜蘆醇對去卵巢大鼠皮膚衰老及沉默信息調(diào)節(jié)因子表達(dá)的影響

況曉東漆文萍1鄢敏肖雯胡明華艾有生熊小亮

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室,江西南昌330006)

摘要〔〕目的建立卵巢切除術(shù)后皮膚老化模型，觀測白藜蘆醇對卵巢切除術(shù)后大鼠皮膚衰老的影響。方法將56只Wistar雌性大鼠隨機分成7組：空白對照組、去卵巢組、雌激素治療組、白藜蘆醇治療組(低、中、高劑量)以及白藜蘆醇和他莫昔芬聯(lián)合治療組。大鼠處死后取皮膚組織，部分組織測定其生物活性酶，部分組織采用Western 印跡方法檢測沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)1蛋白表達(dá)。結(jié)果白藜蘆醇治療組(中、高劑量)、雌激素組分別與去卵巢組比較，超氧化物歧化酶(SOD)活性明顯增高、羥脯氨酸含量增加，丙二醛含量降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表達(dá)明顯增強。并且采用雌激素受體拮抗劑他莫昔芬處理后，能夠明顯拮抗白藜蘆醇組上述作用(P<0.05)。結(jié)論白藜蘆醇通過雌激素受體發(fā)揮抗皮膚衰老作用，并且這一作用與SIRT1蛋白調(diào)節(jié)有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕白藜蘆醇；雌激素；皮膚衰老；SIRT1

中圖分類號〔〕R751.05〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：江西省衛(wèi)生廳課題(No.20092029)

1南昌大學(xué)經(jīng)濟(jì)與管理學(xué)院

第一作者：況曉東(1976-)，男，博士，講師，主要從事炎癥與衰老病理學(xué)研究。

隨著年齡的增長，皮膚會像人體的其他器官一樣逐漸老化，對人們的生活、工作有著復(fù)雜的心理與生理影響，尤其對女性的影響更大〔1〕。女性圍絕經(jīng)期是皮膚衰老的重要時期，在此期間，皮膚組織中產(chǎn)生大量的自由基、激素分泌失調(diào)等導(dǎo)致皮膚老化。因此，抗衰老治療，尤其是對皮膚的抗衰老治療成為近年來的研究焦點之一。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在抗衰老方面作用廣泛而又顯著〔2,3〕。目前已證實攝入白藜蘆醇能使酵母、線蟲、果蠅和低等魚類等的壽命延長。白藜蘆醇在《抗衰老圣典》一書中被列為“100種最熱門的有效抗衰老物質(zhì)”之一，而以白藜蘆醇為有效成分的紅葡萄酒還能夠起到美容抗衰老的作用。本實驗擬在去卵巢大鼠模型的基礎(chǔ)上，觀察對皮膚衰老指標(biāo)的影響，明確白藜蘆醇的抗皮膚衰老的作用及機制。

1材料和方法

1.1材料成年Wistar雌性大鼠(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，2～3月齡，體重(235±23)g。考馬斯亮藍(lán)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒和羥脯氨酸(HYP)試劑盒(南京建成生物制品)。白藜蘆醇(成都思科華公司)，苯甲酸雌二醇注射液(上海通用制藥有限公司)。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)一抗(USA)，GAPDH(USA)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(GenScript，USA)。

1.2方法

1.2.1實驗動物造模去卵巢大鼠模型制作：大鼠適應(yīng)1 w后，腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉、固定，背部切口切除雙側(cè)卵巢，對照組切除部分脂肪組織，分層縫合。去勢術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素(5萬U/只)，以防術(shù)后感染。術(shù)后第四天開始進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢測，連續(xù)7 d時間，如涂片中未見成熟脫落上皮細(xì)胞，無動情周期性變化為模型成功。

1.2.2實驗分組及大鼠皮膚組織酶含量測定56只成年Wistar雌性大鼠被隨機分為7個組：空白對照組、去卵巢組、雌激素治療組、白藜蘆醇治療組(低、中、高劑量)(10、30、60 mg/kg)以及白藜蘆醇與他莫昔芬聯(lián)合治療組(50 mg/kg他莫昔芬+ 60 mg/kg 白藜蘆醇)。除空白對照組，所有各組均采取去勢手術(shù)。每日灌胃1次，第31天處死動物并取材。

取背部脫毛后的皮膚組織約50 mg，制備10%皮膚組織勻漿，采用硫代巴比妥酸(TBA顯色法)測定皮膚中MDA的含量，用化學(xué)比色法測定HYP含量，用鄰苯三酚自氯法測定SOD的活性；取背部脫毛后的皮膚組織，經(jīng)蛋白裂解液裂解后，Western 印跡方法檢測SIRT1蛋白表達(dá)情況。

1.2.3Western 印跡檢測大鼠皮膚組織中SIRT1 蛋白表達(dá)皮膚組織經(jīng)裂解后，收集上清液即為蛋白質(zhì)粗提物，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，上樣前稀釋至相同濃度等量上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，SIRT1一抗4℃孵育過夜，TBST沖洗3次，每次10 min；HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL顯色，曝光(以GAPDH做內(nèi)參)。

2結(jié)果

2.1白藜蘆醇對大鼠皮膚組織酶含量的影響與空白對照組相比，去卵巢組大鼠皮膚中的SOD、HYP的含量均顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)。雌激素治療組、白藜蘆醇治療組(中、高劑量)大鼠皮膚中SOD、HYP含量與去卵巢組相比均顯著增加(P<0.05)，并且顯示他莫昔芬用藥前后SOD、HYP含量有顯著差異(P<0.05)，而白藜蘆醇低劑量組與去卵巢組比較無顯著差異(P>0.05)；MDA 含量比較，顯示雌激素治療組、白藜蘆醇治療組(低、中、高劑量)大鼠皮膚中MDA 顯著降低(P<0.05)，但是他莫昔芬用藥前后MDA 含量則無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2白藜蘆醇對大鼠皮膚組織中SIRT1蛋白含量的影響空白對照組、去卵巢組、雌激素治療組、白藜蘆醇高劑量治療組、白藜蘆醇與他莫昔芬聯(lián)合治療組均可見清晰條帶，且雌激素治療組、白藜蘆醇高劑量治療組條帶明顯強于去卵巢組，而白藜蘆醇與他莫昔芬聯(lián)合治療組條帶與白藜蘆醇高劑量治療組相比條帶明顯減弱。見圖1。

組別SOD(μg/mg)MDA(mmol/mg)HYP(μg/mg)空白對照組52.908±3.0903.998±0.2443.639±0.221去卵巢組34.799±2.7871)9.043±0.7621)1.555±0.3711)雌激素治療組46.351±3.6202)7.072±0.1882)2.793±0.2192)白藜蘆醇低劑量治療組37.141±1.6827.372±0.1462)2.027±0.182白藜蘆醇中劑量治療組41.077±2.2442)7.160±0.1762)2.443±0.662)白藜蘆醇高劑量治療組43.203±2.0312)6.668±0.3622)3.009±0.4792)白藜蘆醇與他莫昔芬聯(lián)合治療組37.154±4.6863)7.157±0.0922.206±0.1753)

與空白對照組比較：1)P<0.05；與去卵巢組比較：2)P<0.05；與白藜蘆醇高劑量治療組比較：3)P<0.05

1：空白對照組；2：去卵巢組；3：雌激素治療組；4：白藜蘆醇高劑量治療組；5：白藜蘆醇與他莫昔芬聯(lián)合治療組 圖1　Western印跡檢測各組大鼠皮膚組織SIRT1蛋白表達(dá)

3討論

研究表明〔4〕，采用雌激素替代療法能顯著改善皮膚衰老帶來的問題。然而，雌激素作為化妝品成分使用是受到嚴(yán)格限制的，研究資料顯示，動物雌激素增加了子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌發(fā)生的危險性〔5〕。近期研究發(fā)現(xiàn)，植物雌激素對人體或動物能發(fā)揮類似動物雌激素樣的活性，卻少有雌激素樣副作用的發(fā)生。白藜蘆醇作為一種植物雌激素，通過與體內(nèi)不同雌激素受體位點結(jié)合而表現(xiàn)雌激素激動或拮抗活性。

研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，白藜蘆醇可能是研發(fā)抗衰老藥物的關(guān)鍵。但是有關(guān)在皮膚衰老方面的研究尚屬罕見，目前為止僅有1篇文獻(xiàn)報道〔6〕：該文采用體外細(xì)胞實驗的方法證實白藜蘆醇能夠通過P53、JNK途徑實現(xiàn)抗皮膚衰老作用，但是白藜蘆醇作為植物雌激素方面的作用并無涉及。在衰老過程中，機體對自由基的清除能力逐漸降低，其代謝產(chǎn)物在組織中不斷堆積。MDA是自由基脂質(zhì)過氧化的分解產(chǎn)物，其水平的變化間接反映了組織中自由基的變化。清除自由基的酶類主要有SOD、過氧化氫酶(CAT)、以GSH-Px為代表的過氧化物酶及谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(G-ST)等。膠原蛋白的主要成分是HYP。機體衰老時，皮膚內(nèi)部成纖維細(xì)胞供氧不足，羥脯氨酸合成減少，進(jìn)而皮膚內(nèi)的蛋白質(zhì)含量也降低。通過測定HYP的含量可以判斷受試動物皮膚衰老的程度。本實驗結(jié)果結(jié)果表明白藜蘆醇可以像雌激素一樣，對抗來自于雌激素下降所帶來的皮膚衰老的問題。雌激素受體拮抗劑他莫昔芬能夠影響白藜蘆醇的這一作用，進(jìn)一步表明白藜蘆醇可能通過雌激素受體發(fā)揮抗皮膚衰老的作用。

近來研究表明，SIRT1可通過其去乙?；饔脕碚{(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能，并具有抗衰老作用。而白藜蘆醇可以作為最強的SIRT1激活劑，可模擬熱量限制抗衰老反應(yīng)，參與有機生物平均生命期的調(diào)控〔7〕。雌激素樣作用和SIRT1作用均具有抗衰老的作用，而白藜蘆醇同時兼具雌激素樣作用和SIRT1作用，因此有理由相信Res在抗皮膚衰老方面必然有著美好的開發(fā)前景。

4參考文獻(xiàn)

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6Cao C,Lu S,Kivlin R,etal.SIRT1 confers protection against UVB- and H2O2-induced cell death via modulation of p53 and JNK in cultured skin keratinocytes〔J〕.J Cell Mol Med,2009;13(9B):3632-43.

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〔2014-05-07修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)