中藥對衰老合并糖尿病小鼠模型的治療效果

黃春燕王娜彭彥樺楊夏玉李連張樹球何勝

(右江民族醫(yī)學(xué)院重金屬與氟砷毒物研究實驗室,廣西百色533000)

摘要〔〕目的探討衰老合并糖尿病(DM)小鼠模型的建立、與老年癡呆關(guān)系及中藥治療。方法小鼠40只，分成四組：治療1組、治療2組、模型組、正常組，每組10只，前3個為造模組，用鏈脲佐菌素(STZ)連續(xù)注射2 d后，再用四氧嘧啶(ALX)對小鼠進行間斷腹腔注射2 d，共注射4 d，建立DM模型；在此基礎(chǔ)上，12 d后皮下注射D-半乳糖和亞硝酸鈉33 d，每日一次。實驗至35 d開治中藥治療，治療15 d結(jié)束實驗。測定造模前，造模后，治療前、后的血糖含量及結(jié)束時血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量。處死動物，取大腦制成10%腦勻漿，測定腦蛋白、乙酰膽堿酯酶(AchE)、谷胱甘肽(GSH)、O-2·清除率、丙二醛(MDA)等。結(jié)果模型組和正常組血糖，造模前、造模后6 d、9 d血糖，模型組與正常組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；造模后18、20、26、46 d血糖模型組與正常組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。治療前血糖含量治療1組、治療2組、模型組、與正常組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；治療后各組血糖含量與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；血清TG治療組明顯降低；TC治療1組明顯降低；腦勻漿AchE正常組、治療組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；腦勻漿 清除率%治療組明顯升高；腦勻漿GSH模型組明顯低于正常組和治療1組；腦勻漿MDA各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論衰老合并DM小鼠模型治療后血糖、血脂明顯降低，腦O-2·清除率、GSH明顯升高，AchE活力也有一定改變。

關(guān)鍵詞〔〕糖尿?。凰ダ?；血糖

中圖分類號〔〕R587.1〔文獻標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：廣西科技廳項目(桂科攻9819009號)

通訊作者：何勝(1962-),男，副教授，主要從事抗衰老藥物的研發(fā)與應(yīng)用研究。

第一作者：黃春燕(1993-)，女，本科在讀，主要從事老年基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。

糖尿病(DM)患者合并阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病率高于正常人〔1，2〕，DM患者又患上AD，其病情嚴(yán)重程度以及治療效果如何，他們之間是否有因果關(guān)系，值得探討。衰老DM模型，通常選用老齡大鼠注射鏈脲佐菌素/四氧嘧啶造模，但成功率低(血糖不高)且死亡率高〔3〕。本實驗為縮短時間、提高成功率，試用鼠齡小的小白鼠，用鏈脲佐菌素(STZ)加四氧嘧啶(ACX)腹腔注射，建立DM，然后皮下注射D-半乳糖加亞硝酸鈉〔4〕，建立擬衰老；并用中藥治療，測定各時期的血糖含量及結(jié)束時的各種生化指標(biāo)，并進行對比分析。

1材料與方法

1.1主要試劑STZ、ALX均為Sigma 產(chǎn)品、鄰甲苯胺、硫脲、硼酸、冰醋酸、過硫酸銨、鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、α-萘胺、鹽酸(Hcl)、三甲基安基甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、正丁醇，均為國產(chǎn)分析純。甘油三酯(TG)測定試劑盒、總膽固醇(TC)測定試劑盒、乙酰膽堿酯酶(AchE)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒、蛋白質(zhì)測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2動物選用健康鼠明種小白鼠40只，由右江民族醫(yī)學(xué)院動物室提供(動物使用許可證：SYXK桂2011-0010，動物生產(chǎn)許可證：SCXK桂2012-0003)，雌雄各半，鼠齡2～3個月。體重質(zhì)量20～25 g。由動物室提供的混合飼料喂養(yǎng)，自由飲水。將白鼠分成四組：治療1、2、3組、正常組，每組10只。分籠喂養(yǎng)，5只/籠，編號，稱體重，測定小鼠血糖。

1.3藥物舒糖寶，用荔枝，番石榴等果類提取制成；抗癡何首烏復(fù)方1號和2號，用何首烏，龍眼肉等不同配方中藥提取制成。

1.4實驗方法衰老DM模型的建立〔5，6〕和中藥治療〔4〕，除正常組(10只)外，其余各組(共30只)用鏈脲佐菌素按76.7 mg/kg體重劑量，用pH4.2的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液15 ml溶解后，作腹腔注射，1次/d，連續(xù)2 d，第3天改用四氧嘧啶(按110 mg/kg體重)用蒸餾水溶解后，作腹腔一次注射，注射后1 w再用四氧嘧啶(按220 mg/kg體重)，作腹腔一次注射。DM造模12 d后，用D-半乳糖(按100 mg·kg-1·d-1)和亞硝酸鈉(45 mg·kg-1·d-1)〔3〕，生理鹽水溶解后連續(xù)皮下注射33 d，每日一次，建立衰老糖尿病。測定造模后6、9、18、20、26 d血糖。造模35 d后，開始中藥治療。治療1組每鼠用舒糖寶0.15 ml原液，蒸餾水稀釋成0.3 ml灌胃，每日一次；治療2組每鼠用舒糖寶0.05 ml原液，蒸餾水稀釋成0.3 ml灌胃，每日一次，連續(xù)3 d；第4天起改藥，治療1組每鼠用抗癡何首烏復(fù)方1號0.1 ml原液，蒸餾水稀釋成0.3 ml灌胃，1次/d；治療2組每鼠用抗癡何首烏復(fù)方2號0.1 ml原液，蒸餾水稀釋成0.3 ml灌胃，1次/d。模型組用等量蒸餾水代替，方法相同。連續(xù)治療15 d結(jié)束；測定治療前后血糖含量。

1.5測定方法血糖測定，從小白鼠尾巴取靜脈血20 μl，用鄰甲苯胺微量法測定〔7〕；超氧陰離子自由基O-2·清除率測定，用化學(xué)比色法，參考文獻〔8〕；TC用COD-CE-PAP法測定；TG用GPO-PAP法測定；蛋白質(zhì)測定用考馬斯亮藍微量法，丙二醛(MDA)用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法測定；GSH測定用GSH可與二硫代二硝基苯甲酸作用生成黃色化合物，進行比色測定；AchE測定用AchE催化水解乙酰膽堿生成膽堿和乙酸，膽堿與巰基顯色劑反應(yīng)生物TNB黃色化合物，比色測定。具體操作均按試劑盒說明書操作。

1.6實驗取材從眼球取血，分離血清待測。處死動物，取大腦，用生理鹽水洗去血液，濾紙吸干多余水分，稱重，在冰浴下用玻璃勻漿器勻漿，用生理鹽水制成10%腦勻漿，在3 000 r/min離心10 min，取上清于另一試管內(nèi)，放冰箱內(nèi)冷凍待用。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS13.0軟件進行方差分析與q檢驗。

2結(jié)果

2.1造模前后各組小鼠空腹血糖(FPG)含量比較造模前模型組與正常組比較，F(xiàn)PG含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。造模后6 d、9 d，造模組與正常組比較差異顯著(P>0.05)。見表1。

2.2DM小鼠注射D-半乳糖及亞硝酸鈉后血糖比較DM造模后18、20、26 d(對應(yīng)癡呆造模5、7、13 d)，造模組與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

2.3DM小鼠治療前后血糖比較治療前各組明顯高于正常組(P<0.01)；治療后各組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，治療組明顯下降。見表3。

組別n造模前造模后6d造模后9d造模組305.35±1.037.39±1.371)7.47±1.711)正常組105.46±1.245.64±1.096.21±0.89

與正常組比較：1)P<0.05

組別n造模后18d(癡呆造模5d)造模后20d(癡呆造模7d)造模后26d(癡呆造模13d)造模組3015.28±0.361)14.22±3.591)12.29±2.671)正常組107.10±0.926.82±2.996.45±1.01

與正常組比較：1)P<0.01

2.4各組治療后血脂及腦勻漿AchE測定結(jié)果治療組TG明顯低于模型組和正常組(P<0.01)；治療1組TC明顯低于其他三組(P<0.05)；模型組AchE明顯高于正常組、治療2組(P<0.05)。見表4。

2.5小鼠治療后10%腦勻漿中腦蛋白、GSH、O-2·清除率、MDA比較10%腦勻漿中腦蛋白各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組GSH明顯低于正常組和治療1組(P<0.05)。 清除率治療1組明顯高于正常組和模型組，治療2組明顯高于正常組(P均<0.05)。MDA各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表5。

組別治療前治療后(16d)治療后(16d,酶法)治療1組10.78±1.081)7.30±1.402)7.34±1.222)治療2組13.87±3.491)8.80±1.352)9.63±0.482)模型組12.39±2.781)12.39±1.1911.24±1.31正常組6.45±1.016.54±0.472)6.21±0.402)

與正常組比較：1)P<0.01，與模型組比較：2)P<0.01

組別nTG(mmol/L)TC(mmol/L)腦AchE(U/mg)治療1組101.39±0.131)2)1.46±0.330.732±0.042治療2組81.59±0.171)2.46±0.444)0.677±0.1392)模型組82.09±0.302.71±0.494)0.850±0.068正常組81.81±0.302.44±0.654)0.670±0.2562)

與模型組比較：1)P<0.01,2)P<0.05；與正常組比較：3)P<0.05；與治療1組比較：4)P<0.01

組別腦蛋白(mg/ml)GSH(mg/gprot)O-2·清除率(%)MDA(nmol/mg)治療1組3.385±0.2001.209±0.1851)34.74±2.310.109±0.019治療2組3.435±0.1331.098±0.10731.71±2.430.103±0.019模型組3.608±0.1570.827±0.05726.22±2.433)0.115±0.012正常組3.637±0.1801.383±0.2222)29.27±4.630.111±0.012

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與治療1組比較：3)P<0.05

3討論

本研究用STZ和ALX造模后6、9 d，連續(xù)二次測定，血糖升高，但均不明顯，造模組與正常組比較，差異顯著，研究中所用的STZ和ALX劑量已比較大，鼠齡小，體重輕(2月，20～25 g)，可能是小鼠對STZ和ALX不太敏感。D-半乳糖常用來建立老年癡呆動物模型，近年有研究用它和STZ一起來建立衰老糖尿病大鼠模型〔5〕，均得到較好的效果，本研究認(rèn)為D-半乳糖長時間大量在體內(nèi)積累，引起半乳糖代謝紊亂，產(chǎn)生了多種不良后果，其一半乳糖還原成半乳糖醇在細(xì)胞內(nèi)積累，引起細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，細(xì)胞腫脹，代謝紊亂，功能障礙，加速衰老；其二是抗氧化系統(tǒng)受損，自由基增加，加速衰老；也有研究認(rèn)為，長時間注射D-半乳糖可誘導(dǎo)胰島素抵抗(IR)，影響胰島素的合成和分泌，可導(dǎo)致糖代謝紊亂，形成衰老DM大鼠模型。因此，本實驗開始用STZ和ALX造模DM時，血糖升高不明顯，注射D-半乳糖后明顯升高，說明是D-半乳糖所起的作用，衰老加速了DM的發(fā)生或加重了糖尿病的病情。

衰老和DM均會造成機體抗氧化功能降低和自由基的增加，O-2·清除率、 GSH下降，治療組所用的何首烏復(fù)方制劑，主要有效成分之一是二苯乙烯苷有提高GSH、清除氧自由基的能力，因而提高了清除率。因而使衰老好轉(zhuǎn)，DM也有一定好轉(zhuǎn)。腦中AchE活力，是與記憶功能有密切關(guān)系的酶類，在腦中主要分布于海馬和皮層部位，在AD中常發(fā)生活力改變，也是目前AD測定的關(guān)鍵指標(biāo)，但可能在發(fā)病不同階段會有不同的變化，因而在文獻報道中，有升高或降低的，本實驗降低了，可能是其原因。 MDA含量各組比較無差異，可能是注射D-半乳糖時間較短或劑量偏低的原因，但有待進一步探討。

4參考文獻

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〔2014-04-29修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)