Aβ影響神經(jīng)細(xì)胞中RXRα與Nur77的核質(zhì)穿梭

劉迎春聶惠蓉沈杰唐建國(guó)姜芬鄭巖松游曉青

(福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，福建福州350108)

摘要〔〕目的探討β淀粉樣蛋白(Aβ)對(duì)維甲類X受體α(RXRα)、孤兒核受體Nur77的生成和亞細(xì)胞定位的影響。方法用Aβ25～35處理小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞(N2a)細(xì)胞，并以阿爾茨海默病(AD)模型小鼠的大腦皮層和海馬組織為研究對(duì)象。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)N2a細(xì)胞和皮層、海馬組織中RXRα、Nur77 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)，應(yīng)用核質(zhì)分離結(jié)合Western印跡檢測(cè)N2a細(xì)胞中RXRα、Nur77蛋白在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的含量，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察N2a細(xì)胞與皮層、海馬細(xì)胞中RXRα、Nur77的亞細(xì)胞定位；流式細(xì)胞儀檢測(cè)N2a細(xì)胞凋亡情況，Western印跡檢測(cè)Bcl-2和Bax表達(dá)量。結(jié)果N2a細(xì)胞經(jīng)Aβ處理24 h后，RXRα mRNA表達(dá)水平下降了16.47%，Nur77 mRNA表達(dá)水平無明顯變化；RXRα、Nur77總蛋白量無明顯變化，但RXRα與Nur77在細(xì)胞質(zhì)中的含量分別由對(duì)照組的2.99%、3.91%增至處理組的21.4%、24.2%；Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax表達(dá)量上升，細(xì)胞凋亡率從對(duì)照組1.23%增至Aβ25～35處理組18.69%；與對(duì)照小鼠比較，AD小鼠中RXRα、Nur77 mRNA表達(dá)水平在大腦皮層無明顯差異，但在海馬中分別增加了8.67%、11.73%；RXRα、Nur77總蛋白量變化無明顯差異，但亞細(xì)胞定位發(fā)生改變，從細(xì)胞核遷移至細(xì)胞質(zhì)增加并伴有凋亡發(fā)生。結(jié)論Aβ可能誘導(dǎo)RXRα與Nur77從細(xì)胞核遷移至細(xì)胞質(zhì)，誘發(fā)凋亡。

關(guān)鍵詞〔〕阿爾茨海默病；RXRα；Nur77；核質(zhì)穿梭

中圖分類號(hào)〔〕R741〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金主任專項(xiàng)基金(81241017)；福建省教育廳項(xiàng)目(JA09122；JA11109)；福建醫(yī)科大學(xué)教授學(xué)術(shù)發(fā)展基金(JS14003)

通訊作者：游曉青(1968-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)退行性疾病研究。

第一作者：劉迎春(1974-)，女，副教授，博士，主要從事神經(jīng)退行性疾病研究。

The effect of Aβ on nuclear-cytoplasmic shuttling of RXRα & Nur77 in neurons

LIU Ying-Chun,NIE Hui-Rong,SHEN Jie,etal.

School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University,Fuzhou 350108,Fujian,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of Aβ on the expression and translocation of RXRα/Nur77.MethodsIn vitro,the N2a cells were treated with Aβ25～35 and ddH2O respectively. The mRNA and protein expression levels of RXRα/ Nur77,which were extracted from cells of N2a/cerebral cortex/hippocampus,were detected by real-time RT-PCR and Western blot,respectively. The protein expression levels of RXRα/Nur77 in the cells/nucleus/cytoplasm were detected by nucleoplasm separation combined with Western blot. The translocation of RXRα/Nur77 were observed by staining the seeded cells and frozen brain tissue sections. Cell apoptosis were detected by flow cytometry.ResultsThe mRNA level of RXRα in N2a cells was increased 16.47% after 24 h treatment with Aβ25～35,but Nur77 remained almost the same compared with that of control cells;the treatment with Aβ25～35 had no significant effect on the RXRα/Nur77 protein expression levels,but the ratio of RXRα/Nur77 in cytoplasm was increased from 2.99%,3.91%(in control group) to 21.4%,24.2%(in Aβ group) respectively;and there was higher expression of Bax and lower expression of Bcl-2 in Aβ group,and the ratio of cells apoptosis(in control group) was increased from 1.23% to 18.69%(in Aβ group). In Alzheimer's disease(AD) mice,the mRNA expression levels of RXRα/Nur77 had no significant difference in the cerebral cortex compared with those of control mice,and the expression levels of RXRα/Nur77 mRNA increased 8.67% and 11.73% respectively in the hippocampus compared with those of control mice. The RXRα/Nur77 protein levels remained the same as those of control mice. While RXRα/Nur77 protein was exported into cytoplasm significantly in the cerebral cortex and hippocampus cells compared with those of control mice,accompanied with cells apoptosis.ConclusionsEither exogenous Aβ or increased Aβ in the impact of brain pathology might affect RXRα/Nur77 nuclear exporting,thus induce cell apoptosis.

【Key words】Alzheimer's disease;RXRα;Nur77;Nuclear-cytoplasmic shuttling

β淀粉樣蛋白(Aβ)生成聚合繼而生成老年斑同時(shí)伴隨神經(jīng)元的損害被認(rèn)為是阿爾茨海默病(AD)病理機(jī)制的中心環(huán)節(jié)〔1，2〕。維甲類x受體α(RXRα)作為配體轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、死亡，和新陳代謝中發(fā)揮重要作用〔3〕?；汉耸荏wNur77是一種類固醇-甲狀腺激素-類維生素A類轉(zhuǎn)錄因子，其功能在很大程度上取決于它的亞細(xì)胞定位。一般情況下Nur77在核內(nèi)發(fā)揮核轉(zhuǎn)錄因子的作用，對(duì)下游基因進(jìn)行調(diào)控；但在某些細(xì)胞外界信號(hào)或自身?yè)p傷刺激下，它可出核定位至線粒體，誘發(fā)線粒體釋放細(xì)胞色素C從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過程〔4〕。由Nur77、RXRα異二聚體出核引發(fā)的細(xì)胞凋亡已在多種細(xì)胞中得到證實(shí)〔5～8〕。這種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制是否適用于AD神經(jīng)元的過度凋亡目前還未可知。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在AD病理狀態(tài)下，RXRα表達(dá)量及活性的改變可影響Aβ的產(chǎn)生〔9〕，這為以RXRα為靶點(diǎn)治療AD的藥物開發(fā)提供了新的思路。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞(N2a)細(xì)胞中，Aβ處理可顯著影響RXRα在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核的分布比例〔10〕。由于RXRα/Nur77異二聚體亞細(xì)胞定位的改變是引發(fā)多種細(xì)胞凋亡的原因之一，我們?cè)O(shè)想AD病理狀態(tài)會(huì)影響RXRα、Nur77的表達(dá)及亞細(xì)胞定位，而這種改變直接引發(fā)AD模擬細(xì)胞的凋亡?；谏鲜黾僭O(shè)，本文將研究Aβ處理的細(xì)胞和過表達(dá)APP的小鼠RXRα、Nur77表達(dá)及亞細(xì)胞定位情況的改變，并探討該變化與神經(jīng)元凋亡之間的關(guān)系。

1材料和方法

1.1主要試劑DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清(Hyclone，美國(guó))；Aβ25～35(Sigma，美國(guó))；兔抗RXRα抗體、兔抗Nur77抗體和羊抗Nur77抗體(Santa Cruz，美國(guó))；兔抗多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP-46D11)抗體和兔抗β-actin(13E5)抗體(CST，美國(guó))；兔抗熱激蛋白60(HSP60)(Abcam，英國(guó))；DyLight 594-驢抗兔IgG二抗和DyLight 488驢抗兔IgG二抗(Earthox，美國(guó))；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；兩步法RT-PCR試劑盒(Invitrogen，美國(guó))；Power 2×SYBR Real-time PCR Premixture和2×PCR Master Mix(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)。

1.2細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物N2a由廈門大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所惠贈(zèng)。 C57BL/6J hAPPK595N/M596L/hPS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠(AD小鼠)和野生型C57BL/6J小鼠，12月齡，購(gòu)于北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1N2a細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)以DMEM(45%)+Opti-MEM(45%)+FBS(10%)為培養(yǎng)液，3 d左右傳代一次，比例為1∶3。傳代后，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(5%CO2，37℃)。

1.3.2熒光定量PCR檢測(cè)將N2a細(xì)胞以1.6×105密度接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)(Aβ)組中加入25 μmol/L Aβ25～35(Aβ25～35粉末事先用雙蒸水溶解，37℃孵育1 w)，對(duì)照(control)組加入等體積的雙蒸水，再培養(yǎng)24 h后收獲細(xì)胞，按照Trizol說明書提取總RNA。分別提取12月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)陽(yáng)性基因小鼠及對(duì)照組大腦皮層和海馬組織的總RNA。以提取的總RNA 為模板，采用BioTeke的Power 2×SYBR Real-time PCR Premixture試劑盒，擴(kuò)增GAPDH、RXRα和Nur77基因。GAPDH、RXRα和Nur77引物由上海公司合成，以GAPDH為內(nèi)參照。引物序列：RXRα：Rs(5'-TCAAGCGCAGACAAGCAGC-3')和Ra(5'-GCCAGGAGAATCCCATCT-3')；Nur77：Ns(5'-GAAGCTCAGGCAGTTTGC-3')和Na(5'-CGCTCTGGTCCTCATCAC-3')。 GAPDH：Gs(5'-AGCCTCCTTGATGGCCTCCTTG-3')和Ga(5'-AGAACATCA TTCCCAGCAGC-3')。反應(yīng)條件為：94℃ 4 min；(94℃ 15 s，60.5℃ 60 s)40個(gè)循環(huán)，60.5℃ 30 s結(jié)束反應(yīng)。熒光定量PCR 結(jié)果以Ct 值表示，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。

1.3.3RXRα和Nur77蛋白表達(dá)分別提取N2a細(xì)胞Aβ25～35組和Control組蛋白、AD小鼠和Control組大腦皮層和海馬組織蛋白。蛋白定量后用Western印跡檢測(cè)N2a細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)鼠的RXRα和Nur77蛋白含量。

將培養(yǎng)好的N2a細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下。采用試劑盒Nuclear Extract Kit(Millipore，美國(guó))分離核質(zhì)。蛋白定量后用Western印跡檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的RXRα和Nur77蛋白含量，以HSP60 和PARP蛋白作為核質(zhì)分離的內(nèi)參。

1.3.4免疫細(xì)胞化學(xué)染色將N2a細(xì)胞以1.6×105密度接種于放入爬片的24孔培養(yǎng)板中，N2a細(xì)胞設(shè)立Control組和Aβ組(處理同1.2.2)。收獲N2a細(xì)胞后，經(jīng)過4%多聚甲醛固定30 min，1%Triton X-100透膜30 min，孵育兔抗RXRα和羊抗Nur77抗體(1∶200稀釋)4℃過夜，加熒光二抗(DyLight 594 抗兔和DyLight 488抗山羊)室溫孵育1 h，DAPI復(fù)染5 min，清洗，封片，激光共聚焦拍照。

1.3.5組織取材與切片取12月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠和對(duì)照C57陰性小鼠，注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉；開胸左心室穿刺灌注生理鹽水(3‰肝素)，取出腦組織加入適量OCT膠包埋，放入液氮中30 s制成凍塊，-80℃保存或置入冰凍切片機(jī)切片，切片厚度8 μm，切片經(jīng)4℃丙酮固定20 min，1%Triton X-100通透，BSA封閉，孵育兔抗RXRα和羊抗Nur77抗體(1∶200稀釋)4℃過夜，加熒光二抗(DyLight 594 抗兔和DyLight 488抗山羊)室溫孵育1 h，DAPI復(fù)染5 min，清洗，封片，激光共聚焦拍照。

1.3.6細(xì)胞凋亡檢測(cè)分別提取N2a細(xì)胞Aβ25～35處理和Control組蛋白、AD小鼠和Control組大腦皮層和海馬組織蛋白。蛋白定量后用Western印跡檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白含量。按Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)試劑盒說明書操作：收集Aβ25～35處理24 h的N2a細(xì)胞及其對(duì)照組細(xì)胞，加入Annexin V-FITC和 PI混勻，室溫避光放15 min，F(xiàn)ACS-Calibur型流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS10.0 軟件行非配對(duì)t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RXRα/Nur77 mRNA水平Aβ25～35短肽處理后的N2a細(xì)胞對(duì)比未處理的N2a細(xì)胞，RXRα mRNA的表達(dá)水平增加了16.47%(P<0.05)，Nur77mRNA表達(dá)水平無明顯變化，下降2.06%；在AD小鼠中，與對(duì)照小鼠比較，在海馬中RXRα mRNA表達(dá)水平增加了8.67%(P<0.05)，而在大腦皮層則無顯著差異(增加2.81%)；Nur77 mRNA的表達(dá)水平在大腦皮層及海馬中分別增加了5.7%、11.73%，均有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。見表1。

指標(biāo)GAPDHRXRαNur77N2a17.86±0.1024.12±0.1823.84±0.53N2a+Aβ17.53±0.2023.57±0.3223.54±0.25Control組 大腦皮層18.44±0.2123.77±0.2723.23±0.70 海馬17±0.2422.47±0.2523.64±0.39AD組 大腦皮層17.87±0.0423.16±0.5022.58±0.31 海馬17.57±0.1422.92±0.4124.05±0.28

2.2AD小鼠大腦皮層及海馬區(qū)細(xì)胞的RXRα與Nur77蛋白定位熒光雙染結(jié)果顯示：在對(duì)照小鼠大腦皮層和海馬區(qū)細(xì)胞中，RXRα與Nur77蛋白大多分布在細(xì)胞核中；與對(duì)照小鼠比較，AD小鼠大腦皮層和海馬區(qū)細(xì)胞中RXRα與Nur77在細(xì)胞質(zhì)中的分布增多，而在細(xì)胞核的分布減少，見圖1，圖2。

2.3N2a細(xì)胞的RXRα/Nur77蛋白熒光染色亞細(xì)胞定位結(jié)果Control組中RXRα、Nur77蛋白幾乎只存在于細(xì)胞核及核周邊；而在Aβ25～35組中，RXRα、Nur77在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有分布，且細(xì)胞質(zhì)中的分布比例增加，發(fā)現(xiàn)紅色標(biāo)記的RXRα與綠色標(biāo)記的Nur77在細(xì)胞質(zhì)中可合成為黃色標(biāo)記，說明RXRα及Nur77有可能是共同出核。見圖3。

2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組N2a細(xì)胞比較，加Aβ25～35處理24 h的N2a細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)量明顯下降，Bax蛋白表達(dá)量顯著上升。相對(duì)對(duì)照小鼠，AD鼠的大腦皮層和海馬區(qū)的Bcl-2表達(dá)量下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)量顯著上升，如圖4。

Annexin V-FITC/PI雙染后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)可見，與control組N2a比較，加Aβ25～35處理24 h的N2a細(xì)胞凋亡率明顯增加(1.23% ±0.35% vs 18.69% ± 1.03%，P<0.01)。

2.5RXRα與Nur77蛋白的Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果在Aβ25～35處理的N2a細(xì)胞和Control組細(xì)胞中，RXRα和Nur77蛋白表達(dá)含量無明顯變化，如圖5A。AD小鼠在皮層中的RXRα蛋白含量比Control組小鼠皮層增加了2.41%，Nur77蛋白含量增加了2.74%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AD小鼠在海馬中的RXRα蛋白含量比Control組小鼠海馬增加了2.58%，Nur77蛋白含量增加了3.53%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，如圖5B。N2a細(xì)胞核質(zhì)分離結(jié)果顯示，RXRα在細(xì)胞質(zhì)中的含量從Control組的2.99%增至Aβ25～35處理組的21.4%；Nur77在細(xì)胞質(zhì)的含量也增多從Control組的3.91%增至Aβ25～35處理組的24.2%，差異顯著(P<0.01)，兩種蛋白出核情況顯著，如圖6。

圖1　小鼠大腦皮層RXRα與Nar77熒光染色(標(biāo)尺:10 μm)

圖2　小鼠海馬區(qū)RXRα與Nur77熒光染色(標(biāo)尺:10 μm)

圖3　細(xì)胞RXRα與Nur77蛋白熒光雙染色(標(biāo)尺:10 μm)

圖4　細(xì)胞與組織中Bcl-2與Bax 蛋白含量的定量分析

圖5　N2a細(xì)胞與腦組織RXRα與 Nur77蛋白含量

圖6　N2a核質(zhì)分離Western印跡結(jié)果

3討論

由Nur77、RXRα異二聚體出核引發(fā)的細(xì)胞凋亡已在多種細(xì)胞中得以證實(shí)，但這種誘導(dǎo)凋亡機(jī)制是否適用于AD神經(jīng)元的過度凋亡，國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。游曉青及其研究小組成員發(fā)現(xiàn)〔9，10〕,在N2a細(xì)胞中，RXRα的表達(dá)量可影響Aβ的分泌，并且，在Aβ病理性增多情況下，N2a細(xì)胞中RXRα蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)生改變，從細(xì)胞核遷移至細(xì)胞質(zhì)。實(shí)時(shí)熒光PCR及Western印跡實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Aβ短肽處理，N2a細(xì)胞RXRα mRNA表達(dá)顯著增加，蛋白水平變化不明顯；其Nur77 mRNA及蛋白表達(dá)水平未見明顯變化。由于體外模擬的AD細(xì)胞并不能完全模擬AD的癥狀，其結(jié)果有一定局限性，因此我們同時(shí)展開了對(duì)動(dòng)物的研究。結(jié)果與細(xì)胞水平上得到的研究結(jié)果大體一致。Akram等〔11〕在55例癡呆患者和18例健康人的研究樣本中發(fā)現(xiàn)，RXRα的表達(dá)水平在AD患者與正常健康者中存在顯著性的差異，在AD早期中RXRα mRNA表達(dá)水平就開始增加并隨著腦癡呆癥狀的加重而增加；當(dāng)認(rèn)知功能開始出現(xiàn)障礙時(shí)，海馬中RXRα蛋白水平開始顯著增加，也隨著腦癡呆癥狀的加重而表達(dá)量增加。而我們的結(jié)果是RXRα mRNA部分組織有顯著增加，RXRα蛋白則均無明顯變化，推測(cè)AD模擬的細(xì)胞及小鼠很可能是處在AD的早期，故處于AD晚期的細(xì)胞及小鼠的RXRα的mRNA和蛋白表達(dá)水平有待于進(jìn)一步的研究。

本文發(fā)現(xiàn)經(jīng)Aβ短肽處理后N2a細(xì)胞的RXRα和Nur77蛋白在核與質(zhì)中的分布發(fā)生了顯著變化，從細(xì)胞核穿梭到細(xì)胞質(zhì)中，核質(zhì)分離結(jié)合Western印跡方法也證實(shí)該現(xiàn)象。在AD小鼠的皮層和海馬細(xì)胞中，觀察到RXRα與Nur77共同出核，在核與質(zhì)中的分布發(fā)生顯著改變，這與細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。且本文表明Aβ可能通過誘導(dǎo)RXRα與Nur77從細(xì)胞核遷移至細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而誘發(fā)凋亡。

綜上所述，我們?cè)贏D模擬的細(xì)胞和動(dòng)物水平上發(fā)現(xiàn)了RXRα、Nur77蛋白的亞細(xì)胞定位改變可能引發(fā)了細(xì)胞凋亡這一現(xiàn)象，為治療AD提供了一種新角度，為研制開發(fā)以核受體RXRα、Nur77為靶點(diǎn)的新型抗AD藥物提供了理論依據(jù)。

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〔2015-04-02修回〕

(編輯李相軍)