山姜素對(duì)急性重癥胰腺炎大鼠肺損傷中水通道蛋白-1表達(dá)的影響

聶容榮袁晟光1劉杰1余水平1唐芳2唐博1

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科,廣西桂林541001)

摘要〔〕目的探討山姜素對(duì)急性重癥胰腺炎(SAP)肺損傷的保護(hù)作用是否與水通道蛋白(AQP)-1表達(dá)相關(guān)。方法選取60只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control組)，假手術(shù)組(Sham組)、模型組(SAP組)、山姜素治療組(Alpinetin組)每組15只。以逆行注入15 g/L 熊去氧膽酸鈉(1 ml/kg)30 s注射制作SAP模型。各組均于造模8 h后剖殺，提取肺組織。檢測(cè)肺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性、濕/干重比及對(duì)肺臟進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分；取材測(cè)定血清腫瘤壞死因子(TNF)-α含量；RT-PCR檢測(cè)肺組織AQP-1 mRNA的表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)肺組織AQP-1的表達(dá)。結(jié)果SAP組與Sham組相比，SAP組肺組織損害程度明顯升高(P<0.01)，血清TNF-α，MPO活性明顯增加(P<0.05)。AQP-1 mRNA與AQP-1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。Alpinetin組與SAP組相比，Alpinetin組肺干/濕比值、肺組織病理?yè)p害程度、血清TNF-α明顯降低(P<0.05)，AQP-1 mRNA和AQP-1蛋白表達(dá)則明顯升高(P<0.05)，AQP-1表達(dá)水平與TNF-α呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論應(yīng)用山姜素能夠?qū)AP肺損傷起到明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制肺組織分泌TNF-α和上調(diào)AOP-1水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕山姜素；急性重癥胰腺炎；肺損傷；水通道蛋白-1

中圖分類號(hào)〔〕R285〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技專項(xiàng)基金資助(GZPT13-45)

通訊作者：唐博(1979-)，男，副主任醫(yī)師，博士，主要從事肝膽胰外科臨床與基礎(chǔ)研究。

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科

第一作者：聶容榮(1981-)，男，副主任醫(yī)師，博士，主要從事中醫(yī)肝病臨床與基礎(chǔ)研究。

急性重癥胰腺炎(SAP)病情兇險(xiǎn)，死亡率高，嚴(yán)重者導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，從而導(dǎo)致多器官障礙〔1,2〕。其中最常見(jiàn)的是急性肺損傷(ALI)〔3〕，是臨床上難治之癥。SAP在中醫(yī)學(xué)中屬于“胃脘痛”、“脾心痛”范疇。《內(nèi)經(jīng)》有言，肺與大腸相表里。若肺臟功能失調(diào)，易致大腸之氣發(fā)生郁塞。此時(shí)如能通導(dǎo)大腸，使得大腸腑氣得以通調(diào)，則可促使肺之肅降功能恢復(fù)正常。肺為相傅之官而朝百脈，百脈順，則諸癥可解〔4〕。本課題前期進(jìn)行了山姜素治療SAP的臨床預(yù)實(shí)驗(yàn)，抗ALI效果令人滿意。本研究旨在進(jìn)一步明確山姜素是否通過(guò)上調(diào)水通道蛋白(AQP)-1的表達(dá)來(lái)達(dá)到減輕ALI的效果。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠60只，體重(250±20)g。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲水，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室溫(20±2)℃，動(dòng)物及飼料均購(gòu)由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)過(guò)桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2藥品及試劑山姜素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α的ELISA檢測(cè)試劑盒，髓過(guò)氧化物酶(MPO)檢測(cè)試劑盒，AQP-1抗體、免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。

1.3動(dòng)物模型與分組大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control組)、假手術(shù)組(Sham組)、模型組(SAP組)、山姜素治療組(Alpinetin組)，每組15只。所有大鼠禁食、自由飲水12 h，1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉。正常對(duì)照組不做任何手術(shù)處理。Sham組模擬造模手術(shù)情況，開(kāi)腹后僅輕度揉搓胰腺、翻轉(zhuǎn)腸管5 min后即關(guān)腹。SAP組采用20 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，動(dòng)物腹部剃毛，消毒術(shù)區(qū)皮膚，無(wú)菌條件下經(jīng)正中切口入腹，在十二指腸乳頭對(duì)側(cè)腸壁插入1 ml小注射器針頭經(jīng)胰腺膽管十二指腸乳頭開(kāi)口入胰膽管，同時(shí)在膽管出肝門處用小動(dòng)脈夾夾閉，逆行注入15 g/L熊去氧膽酸鈉(1 ml/kg)30 s注射造模。Alpinetin組在SAP造模后0.5 h內(nèi)，灌服山姜素80 mg/ml。

1.4標(biāo)本采集及檢測(cè)各組大鼠造?；蛐g(shù)后8 h后處死，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，離心后血清置-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1肺干/濕比值測(cè)定動(dòng)物放血致死后無(wú)菌操作下取左肺葉稱濕重，置60℃烤箱連續(xù)烘烤24 h，去除水分后稱干重。

1.4.2肺組織病理形態(tài)觀察無(wú)菌操作下取出右肺下葉行常規(guī)甲醛固定、石蠟包埋，切片5 μm，HE染色觀察，并行病理學(xué)評(píng)分。

1.4.3血清MPO及TNF-α含量測(cè)定大鼠解剖胸腔暴露肺，夾閉右肺下葉支氣管。自主支氣管灌入無(wú)菌生理鹽水，每次8 ml，共5次，收集灌洗液。將灌洗液以2 000 r/min離心10 min，棄去上清。將沉淀用RPMI1640培養(yǎng)液懸浮，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，置24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。于37℃、5% CO2中培養(yǎng)1 h，用溫培養(yǎng)液沖洗2次，去除未黏附細(xì)胞。然后將黏附細(xì)胞再置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，取上清用于檢測(cè) TNF-α。TNF-α與MPO檢測(cè)用ELLSA法。

1.4.4肺組織中AQP-1免疫組化檢測(cè)取右肺組織常規(guī)脫水、包埋制成蠟塊，用于免疫組化染色，采用SP法，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，按免疫組化試劑盒說(shuō)明書操作。

1.4.5肺組織中AQP-1 mRNA表達(dá)檢測(cè)取右肺組織，提取總RNA。RT-PCR采用一步法。AQP-1引物設(shè)計(jì)，上游為：5′-ATGGCCAGCGAAATCAAGAAG-3′，下游引物為5′-GATATCATCAGCATCCAGGTC-3′。β-actin作為內(nèi)參照，其引物設(shè)計(jì)：上游為5′-GATATCGCTGCGCTCGTCGTC-3′，下游為5′-CATGAGGTAGTCTGTCAGGTC-3′。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸10 s，循環(huán)30次，72℃延伸1 min，最后降至4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳后采用凝膠成像系統(tǒng)記錄分析。

1.4.6肺組織中AQP-1蛋白表達(dá)Western印跡分析肺組織AQP-1蛋白表達(dá)代替。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件行方差分析。

2結(jié)果

2.1大鼠一般情況及死亡率觀察Control組與Sham組大鼠一般狀況較好，術(shù)后無(wú)死亡發(fā)生。SAP組大鼠一般狀況差，出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、懶動(dòng)、豎毛、呼吸急促、拒食等表現(xiàn)，24 h死亡率高達(dá)50%。Alpinetin組大鼠的一般狀況較模型組有不同程度的改善，24 h死亡率也有顯著下降。

2.2肺臟病理學(xué)評(píng)分Control組與Sham組肺臟病理學(xué)大體觀：肺臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)基本正常。SAP組肺臟表面暗紅并伴有點(diǎn)片狀出血灶，水腫明顯。Alpinetin組肺臟見(jiàn)少量出血點(diǎn)，水腫輕。肺泡腔融合形成肺大泡.隨著時(shí)間延長(zhǎng)，上述表現(xiàn)呈逐漸加重趨勢(shì)。按文獻(xiàn)〔5〕肺組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，Control組組織學(xué)評(píng)分顯著高于Sham組〔(0.41±0.43) vs(0.37±0.48),P<0.01〕，而Alpinetin組肺組織炎癥反應(yīng)明顯減輕〔(0.81±0.48)〕，組織學(xué)評(píng)分顯著低于SAP組〔(1.93±0.64),P<0.01〕。

2.3血清及肺組織各項(xiàng)指標(biāo)表1可見(jiàn)，Sham組、Alpinetin組

組別TNF-α(μg/L)MPO(U/g)肺濕/干重比AQP-1mRNAAQP-1蛋白Control組56.31±5.822.82±0.426.53±0.380.782±0.026197±6Sham組74.31±6.433.42±0.726.31±0.250.812±0.029201±7SAP組216.8±15.1311.32±1.269.75±0.370.362±0.01197±5Alpinetin組100.48±30.121)6.91±1.721)6.62±0.411)0.773±0.0121)162±81)F/P值13.37/08.01/021.95/097.78/026.68/0

與SAP組比較：1)P<0.05

與SAP組相比血清TNF-α，MPO水平明顯降低(P<0.05)。SAP組肺干/濕比值明顯增加，Alpinetin組與其相比肺干/濕比值減少(P<0.05)。SAP組AQP-1 mRNA表達(dá)較Sham組顯著下調(diào)(P<0.05)，而Alpinetin組較SAP組AQP-1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)(圖1)。SAP組AQP-1蛋白表達(dá)較Sham組明顯下調(diào)(P<0.05)，Alpinetin組AQP-1蛋白表達(dá)較SAP組明顯上調(diào)(P<0.05)(圖2)。

圖1　各組大鼠造模后肺組織AQP-1 mRNA表達(dá)結(jié)果

圖2　各組大鼠造模后肺組織AQP-1蛋白表達(dá)結(jié)果

3討論

SAP并發(fā)ALI〔3〕，其病情發(fā)展迅速，死亡率高，是臨床上難治之癥。ALI治療的難點(diǎn)之一是因?yàn)橐仍葱苑螕p傷的發(fā)病機(jī)制不甚明了。目前研究表明，胰源性肺損傷的發(fā)病機(jī)制與一系列因素有關(guān)，如細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)過(guò)度釋放〔6，7〕，細(xì)胞凋亡〔8〕，中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞過(guò)度積聚〔7〕等。TNF-α是其中較為重要的炎癥介質(zhì)〔9，10〕。MPO是一種重要的含鐵溶酶體，是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志，其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細(xì)胞(PMN)的功能和活性狀態(tài)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等多方面發(fā)揮作用〔11〕。

AQP是與水的快速轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)的細(xì)胞膜蛋白家族〔12,13〕，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)11種亞型，在肺組織內(nèi)分布的有AQP-1、AQP-3、AQP-4、AQP-5四種，其中肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中AQP-1含量相對(duì)較高〔14〕。AQP-1已經(jīng)被證實(shí)參與了多種肺損傷性疾病的病理過(guò)程〔15〕。AQP-1在SAP并ALI時(shí)表達(dá)與肺水腫的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)〔13〕。SAP在中醫(yī)學(xué)中屬于“胃脘痛”、“脾心痛”范疇?！鹅`樞·本輸》云：“肺合大腸”，肺屬太陰，大腸屬陽(yáng)明。五行同屬金。肺與大腸生理上相互協(xié)調(diào)，病理上相互影響，治療上相互為用?，F(xiàn)代研究表明〔14〕，消化管、呼吸道的上皮組織大多來(lái)源于原始消化管的內(nèi)胚層，這種胚胎學(xué)上的共同來(lái)源被認(rèn)為是“肺與大腸相表里”的生理結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，SAP病程中，因肺失肅降，使得大量的有毒物質(zhì)積聚體內(nèi)，腸道也因此發(fā)生傳導(dǎo)阻滯，出現(xiàn)腑實(shí)壅盛，里熱積聚等證。此時(shí)如能選取合適的方法通利大腸，使腸腑之氣得以通降，則肺之肅降功能也可恢復(fù)正常，肺氣喘逆等癥也能隨之改善。

《名醫(yī)別錄》載：豆蔻味辛，溫，無(wú)毒。主溫中、心腹痛、嘔吐。草豆蔻具有燥濕健脾、溫胃止嘔的功效，在中醫(yī)臨床上用于寒濕內(nèi)阻、脘腹冷痛、噯氣呃逆、不思飲食等癥。山姜素是姜科植物草豆蔻種子團(tuán)中的主要成分，其結(jié)構(gòu)式分別為7-羥基-5-甲氧基二氫黃酮?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山姜素具有明顯的抗菌、抗炎作用〔16，17〕。前期臨床預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，山姜素具有通里攻下作用，能促進(jìn)胃腸道排空，減少腸道細(xì)菌易位，從而起到清熱解毒，抑制肺組織多種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的釋放，發(fā)揮通腑保肺的作用。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明山姜素可有效抑制中性粒細(xì)胞在肺組織的聚集，進(jìn)而減輕SAP并發(fā)的ALI。因此，山姜素對(duì)SAP肺組織具有較全面的保護(hù)作用，可能是上調(diào)AQP-1的表達(dá)來(lái)抑制TNF-α的分泌，達(dá)到減輕肺損傷的效果。

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〔2014-04-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

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