熱休克蛋白60在納洛酮神經(jīng)保護中的作用

丁斐嘉張楠馬驕李凡張蕊李玲1李云鴻王銀

(寧夏醫(yī)科大學寧夏顱腦疾病重點實驗室，寧夏銀川750004)

摘要〔〕目的研究熱休克蛋白(HSP)60在納洛酮神經(jīng)保護中的作用及機制。方法培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞株BV2，實驗分為對照組、陽性對照組(細菌脂多糖，LPS)、實驗組(LPS+納洛酮)。利用Western印跡和免疫熒光技術檢測不同分組中HSP60的表達，ELISA技術檢測HSP60 的胞外釋放。利用人重組HSP60(rhHSP60)作用于BV2細胞，然后用Western印跡技術檢測不同分組中Toll樣受體(TLR)-4的表達；收集細胞培養(yǎng)液，用ELISA檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α和γ-干擾素(IFN-γ)的水平。結(jié)果與對照組相比，陽性對照組中的HSP60和TLR-4表達及TNF-α和IFN-γ的釋放都顯著增加；而加入納洛酮后，實驗組中這些因子的水平都明顯降低(P<0.05)。結(jié)論納洛酮可能通過HSP60-TLR-4 途徑阻止小膠質(zhì)細胞的活化而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

關鍵詞〔〕熱休克蛋白60；納洛酮；TLR-4

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(No.31260243)

通訊作者：王銀(1973-)，女，教授，博士，碩士生導師，主要從事神經(jīng)生物學研究。

The role of HSP60 in the neuroprotective effects of naloxone

DING Fei-Jia,ZHANG Nan,MA Jiao，etal.

Ningxia Medical Oniversity,Key Laboratory of Ningxia Province,Yinchuan 750004,Ningxia,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the function and possible mechanism of HSP60 in the neuroprotective effects of naloxone.MethodsCulturing BV2 cell line were cultured and devided into control,positive control and experimental groups.The expression of HSP60 in 3 groups was measured by Western blot and immunofluorescence technique. The extracellular release of HSP60 was detected by ELISA.The expression of TLR-4 was measured by Western blot after rhHSP60 in BV2 cell,and the releases of TNF-α and IFN-γ were observed by ELISA.ResultsCompared with those of control group,the expressions of HSP60,TLR-4,TNF-α and IFN-γ in positive control group were significantly increased,and their expressions were decreased in experimental group(P<0.05).ConclusionsNaloxone might through HSP60-TLR-4 signal path to inhibit the activation of microglia and play neuroprotective effects.

【Key words】HSP60;Naloxone;TLR-4

1銀川市第一人民醫(yī)院高壓氧科

第一作者：丁斐嘉(1991-)，女，在讀碩士，主要從事神經(jīng)生物學研究。

納洛酮是經(jīng)典的阿片受體拮抗劑，可以阻斷各種病理損害的最后通路，從而起到神經(jīng)保護作用。在臨床上納洛酮常用于腦梗死、新生兒缺血缺氧性腦病等〔1〕。已有研究發(fā)現(xiàn)納洛酮可以阻止小膠質(zhì)細胞的活化〔2〕，但對其作用機制尚不清楚。熱休克蛋白(HSP)60主要位于線粒體內(nèi)，釋放至胞外的HSP60可與細胞膜上的Toll樣受體(TLR)-4受體結(jié)合導致細胞凋亡〔3〕。本研究旨在了解納洛酮的神經(jīng)保護作用與HSP60的關系。

1材料與方法

1.1材料HSP60抗體和人重組HSP60(rhHSP60)蛋白購自ENZO公司；TLR-4抗體購自Abcam公司；全蛋白提取試劑盒購自凱基公司；蛋白定量BCA試劑盒購自Thermo公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；納洛酮和LPS購自Sigma公司；ELISA試劑盒購自欣博盛公司；DAPI染色液購自碧云天公司。

1.2方法

1.2.1BV2小膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細胞在含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用無菌的0.01%PBS充分溶解納洛酮。LPS(1 μg/ml)或rhHSP60(1 μg/ml)處理BV2小膠質(zhì)細胞30 min后，分別加入1 μmol/L的納洛酮溶液，孵育24 h后，收集細胞及上清液。

1.2.2Western印跡檢測蛋白表達藥物處理24 h后，用全蛋白提取試劑盒提取各組蛋白并收集上清液，用BCA法蛋白定量，取等量蛋白，10%SDS PAGE分離后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉膜2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST充分洗滌膜后用二抗室溫孵育1 h，ECL試劑顯色成像。以GAPDH作為內(nèi)參照。

1.2.3ELISA檢測細胞因子的表達應用ELISA試劑盒，按照試劑盒的操作步驟，分別測定各組培養(yǎng)液上清中的TNF-α、INF-γ的表達，最后在酶標儀上540 nm處測定各孔光密度值(OD)。

1.2.4免疫熒光染色技術24孔板中加入細胞爬片，然后培養(yǎng)對照組、陽性對照組(LPS)、實驗組(LPS+納洛酮)。24 h后用PBS清洗玻片，先用4%多聚甲醛常溫固定，然后用含有1% Triton X-100透化處理，用封閉用正常羊血清37℃封閉60 min。用一抗稀釋液(PBST稀釋)4℃孵育過夜，后用PBS清洗玻片，用耦聯(lián)有Alexa Fluor 594染料的二抗稀釋液(PBST稀釋)37℃孵育1 h，用PBS清洗玻片，最后用DAPI和Mount封片。共聚焦顯微鏡下觀察。

2結(jié)果

2.1納洛酮抑制LPS激活后的小膠質(zhì)細胞中的HSP60表達圖1可見，Western印跡結(jié)果顯示，與對照組比較，LPS激活后的小膠質(zhì)細胞中HSP60的表達明顯上揚，而納洛酮可顯著抑制LPS引起的HSP60增加(P<0.05)。免疫熒光染色結(jié)果也證實小膠質(zhì)細胞經(jīng)LPS激活后，HSP60的信號明顯增強，且熒光多分布于細胞膜上，而納絡酮減弱了HSP60的信號。ELISA 結(jié)果顯示納絡酮處理后，由LPS引起的HSP60胞外釋放量明顯被降低。

A：Western印跡結(jié)果；B：ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中HSP60水平；C：免疫熒光染色顯示HSP60表達 圖1　納洛酮對LPS激活的小膠質(zhì)細胞中 HSP60表達和釋放的抑制作用

2.2納洛酮抑制rhHSP60刺激后的小膠質(zhì)細胞中的TLR-4的表達Western印跡結(jié)果表明，與對照組比較，rhHSP60處理后的小膠質(zhì)細胞中TLR-4的表達明顯增加，在納洛酮處理的實驗組中，TLR-4的表達顯著下降(P<0.05)(圖2)。

2.3納洛酮降低rhHSP60處理后的小膠質(zhì)細胞的細胞因子的表達rhHSP60刺激后的BV2小膠質(zhì)細胞中的TNF-α、INF-γ細胞因子的表達顯著增加，而用納洛酮處理后細胞因子的水平降低(P<0.05)(圖3)。

圖2　納洛酮對rhHSP60處理后的 小膠質(zhì)細胞中TLR-4的抑制作用

圖3　納洛酮對rhHSP60處理24 h后的小膠質(zhì) 細胞中細胞因子TNF-α和INF-γ的抑制

3討論

生理狀態(tài)下，HSP60主要位于線粒體或細胞質(zhì)中，對細胞具有抗凋亡和保護作用；然而病理狀態(tài)下，HSP60表達水平變化，亞細胞定位發(fā)生改變，主要位于細胞膜甚至分泌到胞外，則可促進細胞凋亡。Lin等〔4〕報道心力衰竭的心肌細胞中HSP60的表達和定位發(fā)生了改變，認為HSP60 與心肌細胞的凋亡有關。Kim等〔3〕的研究發(fā)現(xiàn)心肌細胞胞外的HSP60 是TLR-4的配體，可以通過與TLR-4結(jié)合激活細胞凋亡通路。

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細胞，受到感染、外傷等因素刺激后活化，產(chǎn)生多種免疫效應分子介導慢性炎癥反應、細胞凋亡等，是導致神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變?nèi)缋夏臧V呆、帕金森病等的主要因素〔5〕。小膠質(zhì)細胞的細胞膜上也存在著TLR-4受體〔6〕，因此我們推測小膠質(zhì)細胞激活后高度表達HSP60，并將其釋放至胞外。胞外的HSP60與細胞膜上的TLR-4受體結(jié)合，激活TLR-4信號通路，介導炎癥因子的釋放。本研究結(jié)果證實了以上推測，說明激活的小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的HSP60可作為內(nèi)源性配體進一步激活小膠質(zhì)細胞導致自身的凋亡 。

目前對于神經(jīng)退行性疾病治療的研究工作有很大一部分是針對抑制小膠質(zhì)細胞活化和細胞因子的分泌，因此尋找合適的藥物至關重要。納絡酮是一種非選擇性G蛋白偶聯(lián)的阿片受體拮抗劑，因其具有抑制花生四烯酸代謝、阻止脂質(zhì)過氧化、促進SOD生成、抑制Ca2+內(nèi)流、提高Na-K-ATP酶活性等活性而被稱為神經(jīng)保護劑〔1〕。在帕金森病動物模型和大鼠神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系中都已證實納絡酮可抑制LPS激活的小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、NO和超氧自由基,減少多巴胺神經(jīng)元的退行性病變，具有神經(jīng)保護作用〔7，8〕。本實驗中納洛酮對rhHSP60激活的小膠質(zhì)細胞的抑制作用,可能就是通過抑制小膠質(zhì)細胞膜上TLR-4的表達，從而阻斷HSP60與TLR-4的結(jié)合，進而抑制TLR-4信號通路炎性因子的釋放而完成的,其具體機制還需進一步研究。

4參考文獻

1孟慶林.鹽酸納洛酮在急診和急性中毒的應用〔J〕.臨床薈萃，1996;11(9)：399-420.

2Cheng WJ,Li YH,Hou XL,etal.HSP60 is involved in the neuroprotective effects of Naloxone〔J〕.Mol Med Report,2014;10(12):2172-6.

3Kim SC,Stice JP,Chen L,etal.Extracellular heat shock protein 60,cardiac myocytes,and apoptosis 〔J〕.Circ Res,2009;105(11):1186-95.

4Lin L,Kim SC,Wang Y,etal.HSP60 in heart failure:abnormal distribution and role in cardiac myocyte apoptosis 〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007;293:H2238.

5Gonzalez-Scarano F,Baltuch G.Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases〔J〕.Annu Rev Neurosci,1999;22(2):219-40.

6Aloisi F.Immune function of microglia 〔J〕.Glia,2001;36(2):165-79.

7Liu B,Du L,Hong JS.Naloxone protects rat dopaminergic neurons against inflammatory damage through inhibition of microglia activation and superoxide generation 〔J〕.J Pharmacol Exp Ther,2000;293(6):607-17.

8Liu Y,Qin L,Wilson BC,etal.Inhibition by naloxone stereoisomers of β amyloid peptide(1～42)induced superoxide production in microglia and degeneration of cortical and mesencephalic neurons 〔J〕.J Pharmacol Exp Ther,2002;302(9):1212-9.

〔2015-01-17修回〕

(編輯徐杰)