低分子肝素對膿毒癥大鼠可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白、可溶性內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體及可溶性E-選擇素的影響

崔雷程青虹1何永來1趙利曾建瓊1

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832002)

摘要〔〕目的探討低分子肝素對膿毒癥大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。方法采用大鼠盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)復(fù)制大鼠膿毒癥模型。清潔級雄性Wistar大鼠104只被隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、膿毒癥模型組和低分子肝素治療組，每組8只，其中后三組按術(shù)后處死時間分為12、24、48、72 h共4個亞組。各組分別在相應(yīng)時間點處死大鼠，經(jīng)腹主動脈取血進(jìn)行常規(guī)檢測，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白(sTM)、可溶性內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(sEPCR)濃度以及炎癥反應(yīng)可溶性E-選擇素(sE-selectin)的含量。結(jié)果正常對照組和假手術(shù)組sTM、sEPCR和sE-selectin的表達(dá)水平均無顯著差異(P均>0.05)。膿毒癥模型組傷后12 h開始在各個時間點sTM、sEPCR和sE-selectin的表達(dá)均有不同程度增高(P均<0.05)，并持續(xù)至傷后72 h；與模型組比較，低分子肝素治療組于CLP后12 h開始，至24、48 h，sTM、sEPCR和sE-selectin的表達(dá)均明顯降低，并持續(xù)至72 h(P均<0.05)。結(jié)論低分子肝素能通過對膿毒癥凝血-炎癥網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，降低膿毒癥大鼠sTM的表達(dá)水平，并降低大鼠體內(nèi)sE-selectin的水平，從而減輕肺組織炎癥損害，在一定程度上緩解膿毒癥的進(jìn)程。

關(guān)鍵詞〔〕膿毒癥；低分子肝素；可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白；可溶性內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體；可溶性E-選擇素

中圖分類號〔〕R631〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81160017)

通訊作者：程青虹(1967-)，男，主任醫(yī)師，碩士，主要從事重癥醫(yī)學(xué)研究。

1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)二科

第一作者：崔雷(1985-)，男，住院醫(yī)師，在讀博士，主要從事重癥醫(yī)學(xué)研究。

Effect of the low-dose heparin on STM and sE-selectin in septic rats

CUI Lei,CHENG Qing-Hong,HE Yong-Lai,etal.

Shihezi University School of Medicine,Shihezi 832002,Xinjiang,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of low-dose heparin injection on pulmonary vascular endothelial cell function of sepsis rats.MethodsSepsis model was produced by cecal ligation and puncture(CLP). 104 healthy male Wistar rats were randomly divided into control,sham operation,cecal ligation and puncture(CLP) model group,and low-dose heparin-treated groups. The three latter groups were divided into four subgroups of 12,24,48 and 72 h with 8 rats in each subgroup. The blood samples of each group were collected at various time points from abdominal aorta to determine the levels of sTM,sEPCR and sE-selectin expression by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsThe levels of STM,sEPCR and sE-selectin expressions had no significant differences among control and sham operation groups(both P>0.05). STM,sEPCR and sE-selectin expressions levels were significantly increased beginning at 12 h in post-CLP(all P<0.05),and were decreased continuing at 72 h. Also,low-dose heparin dramatically decreased STM,sEPCR and sE-selectin levels at 12 h,and markedly decreased at 48 and 72 h compared with those of model group(all P<0.05).ConclusionsLow molecular heparin could pass to sepsis coagulation-inflammation network adjustment,reduce the expression levels of sTM and sE-selectin in sepsis rats so as to reduce the inflammation of lung tissue damage,and it could obviously alleviate the development of sepsis at a certain extent.

【Key words】Sepsis;Low-dose heparin;sTM;sEPCR;sE-selectin

異常的凝血系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，是膿毒癥及多器官功能障礙綜合征(MODS)發(fā)生的重要機(jī)制之一；且膿毒癥與急性肺損傷的病理生理過程類似，都包括由宿主失控的防御反應(yīng)引起炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、促凝活性加強(qiáng)及纖溶活性下降等〔1〕。肝素可激活抗凝血酶發(fā)揮抗凝作用，在膿毒癥治療領(lǐng)域逐漸凸顯其應(yīng)用潛力。低分子肝素(LMWH) 是經(jīng)肝素降解所得的低分子量片段或經(jīng)分級法得到的4 000～6 500 D低分子量組分。該組分具有抗凝血、抗血栓、抗腫瘤等作用，具有生物利用度高、血漿半衰期長、出血副作用少等特點，現(xiàn)已成為肝素類藥物研究的焦點〔2〕。本實驗采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)復(fù)制大鼠腹腔感染的膿毒癥模型，研究LMWH對膿毒癥大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，探討LMWH在膿毒癥防治方面的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料清潔級雄性Wistar大鼠104只，體重220～260 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動物中心。正式實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w。低分子肝素鈉注射液(1 ml：2 500 IU)，杭州九源基因工程有限公司；酶聯(lián)雙抗體夾心ELISA試劑盒，美國Gene May有限公司；TECAN DNA export酶標(biāo)儀，TECAN公司；FRESCO臺式低溫離心機(jī)，賀利氏公司。

1.2動物分組及處理因素隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、膿毒癥模型組(CLP)和LMWH組，后三組再分為術(shù)后12、24、48和72 h組，每組8只。麻醉后開腹，假手術(shù)組僅翻動盲腸，LMWH組經(jīng)CLP術(shù)后立即皮下注射LMWH鈉注射液(100 U/kg)，CLP組行盲腸結(jié)扎術(shù)并穿孔，并注射等量生理鹽水。注射LMWH后在每個時間點每組采血，處死大鼠并取肺組織。應(yīng)用ELISA法測定血清可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白(sTM)、可溶性內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(sEPCR)以及可溶性E-選擇素濃度。

1.3動物模型制備按照Chaudry等〔3〕的方法行CLP，復(fù)制嚴(yán)重腹腔感染致膿毒癥模型。

1.4指標(biāo)的檢測方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)雙抗體夾心法原理定量測定，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件行方差分析。

2結(jié)果

2.1LMWH對膿毒癥大鼠sTM的影響假手術(shù)組與正常對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；與正常對照組和假手術(shù)組相比CLP組和LMWH組中sTM在各時間段的表達(dá)水平均顯著升高(P均<0.01)；但與CLP組相比，LMWH組大鼠sTM表達(dá)量在各個時間點均有所下降，12 h顯著下降，并持續(xù)下降至72 h(P均<0.01)。見表1。

2.2LMWH對膿毒癥大鼠sEPCR的影響正常對照組和假手術(shù)組在各時間點的sEPCR含量無差異(P均>0.05)；而CLP組和LMWH治療組sEPCR含量均顯著高于正常對照組和假手術(shù)組(P<0.05)。與CLP組比較，LMWH治療后的sEPCR含量顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3LMWH對膿毒癥大鼠sE-selectin的影響正常對照組和假手術(shù)組各時點sE-selectin無差異(P均>0.05)；與正常對照組和假手術(shù)組相比較，CLP后12 h內(nèi)sE-selectin開始上升，隨時間延長，sE-selectin含量呈逐漸上調(diào)的趨勢，24 h達(dá)高峰，且持續(xù)至傷后72 h(P均<0.05)。而與CLP組比較，LMWH組sE-selectin表達(dá)較CLP后12 h有所下降，于術(shù)后24 h進(jìn)一步降低，持續(xù)至72 h(P均<0.05)。見表3。

組別正常對照組假手術(shù)組CLP組LMWH組12h20.8±4.321.9±3.930.6±5.11)23.4±3.41)2)24h21.6±3.820.8±4.153.6±7.11)41.5±4.21)2)48h22.6±4.122.0±4.276.2±9.21)41.9±5.11)2)72h21.9±4.021.9±4.177.8±9.41)39.6±4.61)2)

與對照組比較：1)P<0.05；與CLP組比較：2)P<0.05；下表同

組別正常對照組假手術(shù)組CLP組LMWH組12h116.2±5.7117.3±6.0165.3±9.61)155.2±8.91)2)24h117.3±6.0118.0±5.7163.2±8.71)150.3±7.61)2)48h115.8±6.1119.6±6.2169.1±9.01)146.0±6.71)2)72h118.0±6.3118.3±5.9161.3±7.61)132.6±6.41)2)

組別正常對照組假手術(shù)組CLP組LMWH組12h11.6±1.010.1±1.222.3±3.21)15.3±2.11)2)24h10.4±1.211.7±0.950.9±3.01)21.4±2.81)2)48h12.8±0.911.0±1.051.6±2.51)30.2±2.31)2)72h10.5±1.111.2±1.146.9±3.11)25.6±2.21)2)

3討論

機(jī)體發(fā)生膿毒癥時，炎癥細(xì)胞過度激活，可通過各種途徑激活凝血系統(tǒng)，隨即機(jī)體產(chǎn)生抗凝物質(zhì)并啟動纖溶系統(tǒng)。同時，纖溶系統(tǒng)及生理性抗凝系統(tǒng)受到不同程度地抑制，血液處于高凝狀態(tài)，微血管內(nèi)微血栓大量形成，從而微循環(huán)障礙〔4〕。隨后，人們逐步認(rèn)識到膿毒癥是炎癥反應(yīng)，是凝血/纖溶系統(tǒng)障礙及免疫功能紊亂等眾多因素相互影響、相互作用的結(jié)果。

Cornet等〔5〕曾指出肝素(類肝素樣物質(zhì))可能發(fā)揮與活化蛋白C相同的抗凝及抗炎作用，且肝素價格便宜，易獲取。有研究〔6〕報道LMWH除具有抗凝作用外，另外還具有抗血栓這一重要作用。由于凝血酶的激活是血栓形成的主要原因之一，而LMWH具有較強(qiáng)抗FXa作用，因此能夠抑制凝血酶的激活；LMWH還具有抑制血小板聚集〔7〕、降低血液黏度、改變血液流變特性、維持血液正常的流動等作用。以上特性說明低分子肝素具有抗血栓作用。曹蘋等〔8〕結(jié)果表明LMWH對凝血系統(tǒng)的作用低于普通肝素(UFH)，而其抗血栓作用大于UFH。

血管內(nèi)皮細(xì)胞在對抗血小板聚集、維持血管壁完整性等方面均具有重要的意義，并且還參與調(diào)節(jié)纖溶過程。E-selectin作為內(nèi)皮細(xì)胞合成的一種表面糖蛋白，是細(xì)胞黏附分子選擇素家族成員之一，不僅能夠介導(dǎo)白細(xì)胞在血管內(nèi)皮表面的運動，還與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系〔9〕。由于正常組織中的內(nèi)皮細(xì)胞一般不表達(dá)E-selectin，只有當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到某些細(xì)胞因子刺激而被激活時才表達(dá)，因此E-selectin表達(dá)水平可在一定程度上反映癌癥的病理進(jìn)展及轉(zhuǎn)移情況。E-selectin屬于黏附分子選擇素家族，主要表達(dá)于活化的內(nèi)皮細(xì)胞與多種腫瘤患者內(nèi)皮細(xì)胞表面，釋放入血后成為sE-selectin，檢測sE-selectin水平也可判定膿毒癥病變程度和病情，具有十分重要的臨床價值。同時，sE-selectin可作為機(jī)體炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物之一，本次研究結(jié)果顯示，膿毒癥組sTM從12 h開始逐漸升高，48 h達(dá)到高峰；應(yīng)用LMWH治療后內(nèi)的sTM表達(dá)含量明顯下降，這可能與相關(guān)研究認(rèn)為血清sE-selectin水平可反映血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化狀態(tài)〔10〕，與多種疾病病情的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

TM作為蛋白C(PC)系統(tǒng)的重要組成部分，具有抗血栓形成、纖溶及抗炎等特性，可改善微循環(huán)、減緩器官功能障礙，在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損時，TM脫落進(jìn)入血液，導(dǎo)致STM升高。本研究表明LMWH可以有效地降低膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞的損失，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的改善。

本研究結(jié)果表明，LMWH可以減輕膿毒癥小鼠的炎癥反應(yīng)，有效地發(fā)揮抗血栓、抗凝血及抗炎等作用，通過對膿毒癥凝血-炎癥網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，從而減輕肺組織炎癥損害，且在一定程度上緩解膿毒癥的發(fā)生發(fā)展，提示LMWH具有臨床治療膿毒癥、減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷的應(yīng)用潛力。但血管內(nèi)皮細(xì)胞與其他炎癥細(xì)胞在發(fā)生膿毒癥中的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

1Vincent JL，Sakr Y，Sprung CL，etal.Sepsis in European intensive care units：results of the soap study〔J〕.Crit Care Med，2006；34(2)：344-53.

2張治云，凌沛學(xué)，王鳳山，等.低分子肝素藥理作用研究進(jìn)展〔J〕.食品與藥品，2006;8(1A)：7-9.

3Chaudry IH，Wichterman KA，Baue AE.Effect of sepsis on tissue adenine nucleotide levels〔J〕.Surgery，1979;85(2)：205-11.

4Bauer I，Bauer M，Raddatz A，etal.Influence of gender on stimulated cytokine response in patients with severe sepsis〔J〕.Anaesthesist，2006;55(5)：515-27.

5Cornet AD，Smit EG，Beishuizen A，etal.The role of heparin and allied compounds in the treatment of sepsis〔J〕.Thromb Haemost，2007;98(3)：579-86.

6李曉祥，李耐三.低分子量肝素的抗血栓作用〔J〕.藥學(xué)進(jìn)展，1994;18(1)：6-10.

7安寧飛，劉玉蘭.低分子肝素的抗血栓作用〔J〕.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2000;17(2)：136-9.

8曹蘋，張麟生.低分子肝素的抗凝與抗血栓作用〔J〕.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2001;21(5)：289-91.

9Brodt P，F(xiàn)allavollita L，Bresalier RS，etal.Liver endothelial E-selectin mediates carcinoma cell adhesion and promotes liver metastasis〔J〕.Int J Cancer，1997;71(4)：612-9.

10岳志勇，時光剛.鼻竇癌患者血漿可溶性E-選擇素的含量及意義〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志，2002;10(3)：123-4.

〔2014-11-19修回〕

(編輯袁左鳴)