結直腸癌組織中PAQR3、PDCD4基因甲基化水平與結直腸癌的關系

李日恒楊瑞紅1宋艷敏張濤李青2呂志剛3張愛民安宇亮

(河北大學附屬醫(yī)院，河北保定071000)

摘要〔〕目的研究結直腸癌組織抑癌基因PAQR3、PDCD4甲基化水平，以及二者與結直腸癌臨床資料之間的關系。方法收集2013～2014年結直腸癌及癌旁正常組織標本各54例，用甲基化特異性PCR(MSP)法檢測結直腸標本中PAQR3、PDCD4基因甲基化水平。結果(1)PAQR3癌組織和癌旁組織甲基化率分別為 33.3%(18/54)和5.6%(3/54)，差異顯著(P<0.05)；PDCD4癌組織和癌旁組織發(fā)生甲基化率為分別為53.7%(29/54)和7.4%(7/54)，差異顯著(P<0.001)。二者同時檢測的甲基化陽性率為87%，PAQR3和PDCD4沒有相關性(R=0.155，P=0.408)。(2)結直腸癌組織中PAQR3基因甲基化與性別、腫瘤部位無關，年齡越大、分化程度越低、淋巴結轉移、浸潤越深者，PAQR3甲基化發(fā)生率越高。結直腸癌組織中PDCD4 基因甲基化與性別、年齡、腫瘤部位無關，分化程度越低、淋巴結轉移、浸潤越深者，PDCD4 甲基化發(fā)生率越高。結論結直腸癌中PAQR3、PDCD4發(fā)生了甲基化，PAQR3基因甲基化水平與年齡、分化程度、有無淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度有關，PDCD4 甲基化水平與分化程度、有無淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度有關。

關鍵詞〔〕PAQR3;PDCD4;甲基化;結直腸癌

中圖分類號〔〕R735〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河北省科技計劃項目(132777248)；2015年度河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃項目(20150069)

1任丘市婦幼保健院2河北省容城中醫(yī)院

3河北省清苑縣醫(yī)院

第一作者：李日恒(1972-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事普外科疾病研究。

結直腸癌的發(fā)生機制是復雜的。表觀遺傳學改變是一種不發(fā)生基因序列變化的基因表達異常，包括組蛋白印記、基因甲基化?；蚣谆悄[瘤的早期事件且過程可逆，為甲基化相關的基因應用與臨床的早期診斷和治療提供了理論依據(jù)〔1，2〕。 PAQR3屬于孕酮和脂聯(lián)素受體(PAQR)家族中的一員，在結直腸癌細胞中發(fā)揮抑癌基因的作用，參與細胞的各種信號轉導、能量代謝、細胞分裂增殖、分化和生殖細胞的成熟等生物學過程，主要通過負性調節(jié)Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，達到調控細胞增殖、分化、凋亡及細胞惡性轉化、癌癥的發(fā)生發(fā)展等生理過程的目的〔3～7〕。在胃癌組織中，PAQR3負性調控ERK和AKT的磷酸化，證明PAQR3通過抑制ERK和AKT的信號通路負性調節(jié)EMT的過程〔8～11〕。

PDCD4是與細胞凋亡相關的抑癌基因，參與細胞的轉錄、翻譯及多種信號通路，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。已經證實PDCD4在多種腫瘤組織中表達降低，其表達水平與多種腫瘤患者的預后有關，高表達的PDCD4還能增加化療藥物的感性〔12～14〕。PAQR3和PDCD4作為結直腸癌中的抑癌基因，其沉默機制并不明確，目前也沒有聯(lián)合檢測二者甲基化的報道。本文擬探討PAQR3、PDCD4在結直腸癌中基因甲基化及二者的關系，為結直腸癌的診斷和治療提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1標本來源及存儲方法54對結直腸癌組織、正常組織取自河北大學附屬醫(yī)院普通外科，收集標本時間為2013～2014年。納入標準：患者術前均未接受放療、化療或免疫治療，收集癌組織標本時除外已發(fā)生壞死的腫瘤組織，癌旁正常組織取距癌組織邊緣>10 cm的正常組織，組織取全層，診斷結果均由術后病理結果確定。男32例，女22例；直腸癌19例，結腸癌35例；年齡36～82歲，平均59.69歲。術中立即取標本放置于液氮中，-80℃低溫保存，時間不超過6個月。

1.1.2主要試劑QIAGEN EpiTect Fast DNA Bisulfite試劑盒、蛋白酶K、RNaseA、EP管、槍頭、8聯(lián)排均由石家莊市惠友生物科技有限公司提供，β-actin引物、PAQR3甲基化和非甲基化引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成。實驗中DNA提取及核酸電泳過程中所需的STE裂解液、SDS、氯仿、異戊醇、無水乙醇、75%無水乙醇、Tris-飽和酚、酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)、氯仿/異戊醇(24∶1)、TE緩沖液、無水醋酸鈉等均由河北大學附屬醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2甲基化特異性PCR(MSP)酚/氯仿抽提法提取組織DNA，根據(jù)EpiTect Fast DNA Bisulfit Kit 試劑盒說明書進行亞硫酸氫鹽修飾。PAQR3甲基化和非甲基化引物通過MethPrimer軟件設計，PAQR3甲基化引物(M)：5’-TTGTTGAAGAGCGCGTATTATATC-3(正義)，5’-TAAAAACCCGAAAATCTACTCGTA-3’(反義)，非甲基化引物(U)：5’-TTGTTGAAGAGTGTGTATTATATTGA-3’(正義)，5’-TAAAAAACCCAAAAATCTACTCATA-3’(反義)；PDCD4甲基化引物(M)：5’-TTTAGTTTCGGTTTCGTCGTTAC-3’(正義)，5’-GAAAAATCTCTAACCCTTCTCGC-3’(反義)；非甲基化引物(U)：5’-TTTAGTTTTGGTTTTGTTGTTATGA-3’(正義)，5’-CAAAAAATCTCTAACCCTTCTCACT-3’(R)。內參基因β-actin引物：5'-GTG GAC ATC CGC AAA GAC-3'(正義)，5'-AAA GGG TGT AAC GCA ACT AA-3'(反義)，擴增后的產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀分析。

1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS16.0軟件進行χ2檢驗、Spearman相關分析。

2結果

2.1結直腸癌組織中PAQR3、PDCD4基因甲基化水平結直腸癌組織中PAQR3甲基化率為33.3%(18/54)，明顯高于癌旁正常組織〔5.6%(3/54)〕(P<0.05)，見圖1。結直腸癌組織中PDCD4甲基化發(fā)生率為53.7%(29/54)，明顯高于癌旁正常組織〔7.4%(7/54)〕(P<0.001)，見圖2。二者聯(lián)合檢測的甲基化的陽性率為87%。PAQR3和PDCD4沒有相關性(R=0.155，P=0.408)。

2.2PDCD4、PAQR3、基因甲基化與結直腸癌臨床資料之間的關系結直腸癌組織中PAQR3基因甲基化與性別、腫瘤部位無明顯相關性，年齡越大、分化程度越低、淋巴結轉移、浸潤越深者，PAQR3甲基化率越高；反之，越低。結直腸癌組織中PDCD4 基因甲基化水平與性別、年齡、腫瘤部位無關，分化程度越低、淋巴結轉移、浸潤越深者，PDCD4 發(fā)生率越高；反之，越低。見表1。

c：結直腸癌組織，n：癌旁正常組織，下圖同 圖1　結直腸癌組織中PAQR3 MSP擴增產物電泳圖

圖2　結直腸癌組織中PDCD4 MSP擴增產物電泳圖

臨床資料nPAQR3甲基化P值PDCD4甲基化P值性別男3211(34.4)0.84517(53.1)0.918女227(31.8)12(54.5)年齡(歲)<60296(20.7)0.03416(55.2)0.816≥602512(48.0)13(52.0)部位結腸3510(28.6)0.31419(54.3)0.907直腸198(42.1)10(52.6)分化程度Ⅰ～Ⅱ級3015(50.0)0.00411(36.7)0.005Ⅲ級243(12.5)18(75.0)淋巴轉移無284(14.3)0.03610(35.7)0.006有2614(53.8)19(73.1)浸潤深度黏膜肌層3114(45.2)0.03212(38.7)0.010漿膜周圍234(17.4)17(73.9)

3討論

PAQR3基因能在結直腸癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。參與了細胞的各種信號通路，能影響細胞能量代謝、分裂增殖、分化以及生殖細胞成熟等生物學過程，又名 PKTG，可以編碼出37 kD大小的、N端朝胞質、C端朝細胞器、位于高爾基體膜上的7次跨膜蛋白，能負性調控Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，此信號通路是經典的絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)信號途徑之一。此外，PAQR3通過另外兩種機制負性調控AKT信號通路，一方面，PAQR3敲除后，胞質中與高爾基體結合的p110表達降低，PAQR3結合并改變胞質中PI3K復合物的p110的亞細胞定位，阻止與p85調控位點的結合，導致PI3K失活以及AKT磷酸化，此過程也影響胰島素的信號通路；另一方面，PAQR3可以阻斷GPCR的Gβ位點，抑制AKT在GRCR激活的Gβ/γ位點的作用。Wang等〔15〕也證實PAQR3基因在結直腸癌組織中發(fā)揮抑癌的作用，PAQR3表達缺失縮短了PAQR3基因敲除后裸鼠的存活時間。在人類黑色素瘤A375的研究中，PAQR3過表達能明顯抑制細胞的擴增及惡性轉化，裸鼠成瘤實驗中，通過si-RNA技術使PAQR3重新表達能明顯抑制皮下成瘤的作用，其下游被異常激活的ERK活性明顯受到抑制〔16〕。

PDCD4是一種抑癌基因，參與細胞的轉錄、翻譯及多種信號通路，共同發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。PDCD4除了在腫瘤細胞中發(fā)揮抑制轉錄、促進凋亡、調節(jié)細胞周期等作用，還能影響細胞類型的激活。

基因甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件，可以作為結直腸癌的診斷依據(jù)。目前還沒有關于PAQR3基因甲基化的報道。本研究證實了PAQR3基因甲基化參與結直腸癌的形成，可以作為結直腸癌的腫瘤標記物。之前的相關研究證實了PDCD4表達沉默與多種腫瘤形成有關，而PDCD4表達沉默的機制很復雜，基因甲基化就是其中的一種，例如Gao等〔14〕同時檢測了8種膠質瘤細胞系中PDCD4基因的甲基化水平，其中5個發(fā)生了完全甲基化，2個發(fā)生了部分甲基化，1個未發(fā)生甲基化，由于甲基化的過程是可逆的，用去甲基化藥物5-氮雜-2-脫氧胞苷處理后，PDCD4重新表達，細胞分化及轉移能力減弱。在不同組織中，PDCD4基因甲基化水平不同，本研究中證實了PDCD4基因在結直腸癌中發(fā)生了甲基化，而不是完全甲基化，說明甲基化在沉默基因的過程中只發(fā)揮了部分的作用，與癌旁正常組織有統(tǒng)計學差異，說明PDCD4基因甲基化在結直腸癌的形成中發(fā)揮了作用。單獨基因甲基化檢測無法確定其在結直腸癌中的作用，多種基因甲基化對于結直腸癌診斷提供更為準確的依據(jù)。之前關于聯(lián)合基因檢測基因甲基化的報道有很多，能提高甲基化檢出率。James等〔17〕同時檢測了結直腸癌中DKK1和SFRP1啟動子甲基化狀態(tài)，并說明DKK1和SFRP1甲基化與結直腸癌的發(fā)生有關，SFRP1在結直腸癌中最易發(fā)生甲基化。盡管我們分析二者在甲基化方面沒有相關性，但二者聯(lián)檢提高了甲基化的陽性率，為結直腸癌診斷提供了依據(jù)。同時我們發(fā)現(xiàn)PAQR3甲基化水平與年齡有關，年齡越大PAQR3基因甲基化率越高；而PDCD4基因甲基化水平與年齡無關，分析基因甲基化與年齡相關性，隨著年齡的增大，機體甲基化水平越高但年齡相關的甲基化水平改變的機制仍不是很明確，這種關系在不同的研究中說法不一，首先考慮年齡增大后，體內酶活性發(fā)生了改變，促進基因發(fā)生甲基化；此外，可能受地理環(huán)境因素及隨機抽樣、樣本量大小的影響，考慮這種差異無顯著意義〔18〕?；蚣谆悄[瘤發(fā)生的早期事件〔19〕，分化程度越低，基因甲基化水平越高，基因表達水平越低，發(fā)揮抑癌作用的能力越差。隨著分化程度的升高，甲基化發(fā)生的概率越低。因此，在分化程度越高的腫瘤組織中，基因甲基化的概率越高。二者甲基化與結直腸癌浸潤深度和有無淋巴結轉移有關，考慮為二者基因沉默所致；同時，二者可以作為結直腸癌的監(jiān)測預后指標。

本研究證實了PAQR3和PDCD4基因甲基化在結直腸癌中的作用，為進一步體外實驗、逆轉基因甲基化、重新表達抑癌基因提供了切實有效的理論依據(jù)。

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〔2015-01-19修回〕

(編輯徐杰)