郝桂英，楊應東，楊光友

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，雅安625014；2.西昌學院，西昌615013；3.四川省攀枝花市農(nóng)林科學研究院畜牧水產(chǎn)所，攀枝花617061）

·簡報·

四川省山羊多頭蚴線粒體cox2基因序列測定及種系發(fā)育分析

郝桂英1,2，楊應東3，楊光友1

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，雅安625014；2.西昌學院，西昌615013；3.四川省攀枝花市農(nóng)林科學研究院畜牧水產(chǎn)所，攀枝花617061）

應用線粒體細胞色素氧化酶第Ⅱ亞基（cox2）基因作為分子標記，對四川省12個山羊源多頭蚴樣品的cox2基因部分序列（pcox2）進行PCR擴增，分析其種內(nèi)變異并重建系統(tǒng)進化樹。序列分析結果顯示所獲得的pcox2序列長度為531 bp，共檢測到8個變異位點，變異率為0～1.3%。基于pcox2序列構建的系統(tǒng)進化樹顯示多頭蚴四川分離株與已知多頭帶絳蟲位于同一分支，且腦源和肌間多頭蚴聚在一起，均為多頭帶絳蟲。結果表明，多頭蚴cox2基因種內(nèi)存在一定的遺傳差異，但種內(nèi)相對保守，與帶屬其他絳蟲種間差異較大，故可作為多頭帶絳蟲種間遺傳變異研究的分子標記。這一研究結果也為山羊多頭蚴病的分子診斷奠定了基礎。

多頭蚴；山羊；cox2基因；種系發(fā)育關系

腦多頭蚴（Coenurus cerebralis）又稱腦包蟲，是多頭帶絳蟲（Taenia multiceps）的中絳期幼蟲，主要寄生于綿羊、山羊、黃牛、牦牛、水牛、駱駝、鹿、羚羊、羚牛等家養(yǎng)及野生有蹄類草食動物的大腦，偶有寄生于脊髓、肌間和腹腔[1-3]，引起動物的腦多頭蚴病，人也可感染[4]。腦多頭蚴呈世界性分布，在中國許多省、市均有報道，尤以西北、華北、東北等廣大牧區(qū)常見[5]。

目前，絳蟲分類主要依據(jù)其形態(tài)學、生活史、宿主范圍、流行病學調(diào)查、生態(tài)學、分子生物學分析等方面進行鑒定和區(qū)分。但傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法對形態(tài)相近的蟲種難以鑒別。

另外，隨著人類活動的干擾，部分絳蟲的宿主范圍和地理分布呈現(xiàn)擴大趨勢，這對根據(jù)已有生活史、宿主范圍、流行病學調(diào)查、生態(tài)學資料進行鑒定起到很大的干擾。隨著分子生物學以及生物信息學的迅速發(fā)展，絳蟲種類的鑒定越來越趨向于利用基因間的差異。絳蟲的基因組不會因宿主、環(huán)境、不同發(fā)育階段以及翻譯后修飾等因素的誘導而發(fā)生變異[6]。其中線粒體基因由于其具有高突變率、不同種間差異較大等特征，可以從分子水平上對種內(nèi)和種間的遺傳變異進行分析，已成為絳蟲種類鑒定的熱點[7]。

本研究應用線粒體DNA（mtDNA）中cox2基因作為分子標記，對我國四川省12個多頭蚴樣品種內(nèi)變異進行了分析，并探討了其與其他帶屬絳蟲的系統(tǒng)進化關系，從而明確cox2基因能否成為理想的種間遺傳標記，同時為山羊多頭蚴病的分子診斷奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 多頭蚴的采集12個多頭蚴樣品分別采自四川省攀枝花市、雅安市和成都市金堂縣。將采集的多頭蚴外層結締組織膜剝離得到原頭蚴，用滅菌生理鹽水清洗3次，分別編號（見表1），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 部分帶屬絳蟲的線粒體cox2基因序列信息Table1 Sequence information of mitochondrial cox2 gene partial Taenia

1.2 基因組DNA的提取用剪刀剪取各樣品的原頭蚴約20 mg于研缽中研碎，加入DNA裂解液和蛋白酶K消化過夜后，用酚/氯仿法[8]提取多頭蚴基因組DNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 pcox2序列的擴增、純化與序列測定根據(jù)GenBank上已收錄的多頭帶絳蟲線粒體全基因組（登錄號：NC_012894）的cox2基因全序列設計1對引物。pcox2 P1：5′-AAGTTGGTTACTGGGGAGA-3′，pcox2 P2：5′-CCACATCAACAACCTCAAT-3′。引物序列由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。擴增體系為50 μL：2×Taq PCR MasterMix 25 μL，引物P1、P2（10 μmol/L）各2 μL，模板DNA 2 μL，滅菌ddH2O 19 μL。同時，以ddH2O代替模板DNA作空白對照。擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，42℃復性30 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。反應結束后取5 μL PCR擴增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小、純度及亮度。

使用柱式DNA膠回收試劑盒進行DNA的回收純化，回收產(chǎn)物送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行正反雙向測序。

1.4 序列分析與系統(tǒng)進化分析從GenBank檢索到已收錄的7種其他帶屬絳蟲的線粒體全基因組，下載其相應的pcox2基因序列（表1），然后用Clustal X 1.81軟件進行序列比對，MEGA 5.0軟件分析堿基組成、轉換/顛換比率，基于K2P模型計算遺傳距離。用DNAStar 中的MegAlign程序進行序列同源性分析。用DNASP 4.0軟件計算多態(tài)位點數(shù)（number of polymorphic sites，S）、單倍型數(shù)（haplotypes，H）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，Pi）、單倍型多樣性（haplotypes diversity，Hd）和平均核苷酸差異（average number of nucleotide differences，K）。

以帶科棘球?qū)俚募毩＜蚪{蟲（Echinococcus granulosus）（GenBank登錄號：NC_008075）作為系統(tǒng)發(fā)育分析的外群，采用K2P模型，用MEGA 5.0軟件構建NJ樹，并進行重復1000次的自舉檢驗（bootstrap test）。同時以Mrbayes3.1.2軟件構建貝葉斯樹。

2 結果與討論

2.1 pcox2序列組成和相似性對12個多頭蚴樣品的pcox2基因序列進行排序分析后，去掉引物序列，得到531 bp的基因片段（占全長的92%）。pcox2序列沒有堿基插入/缺失，其中保守位點523個，變異位點8個（占1.5%），包括7個簡約信息位點和1個單變異位點。變異僅發(fā)生在密碼子的第3位和第1位，其中第3位占87.5%。A、T、C、G堿基的平均含量分別為25.8 %、42.2 %、10.6%、21.4%，表現(xiàn)出明顯的AT偏倚，這與賈萬忠等[9]報道的結果相似，這可能由序列變異或選擇壓力造成的。序列中轉換多于顛換，轉換/顛換（R）為2.382。其中T與C、A與G間的轉換均為3個，T與G、C與G間的顛換均為1個。

12個多頭蚴樣品的pcox2序列的核苷酸相似性為98.7%～100%，共得到4條不同的序列，序列比對結果見圖1。測序序列與已知多頭帶絳蟲的同源基因核苷酸相似性為98.1%～98.9%，與其他帶屬絳蟲的cox2同源基因序列相似性低于92.1%。本研究測定的12個多頭蚴樣品pcox2序列的堿基變異率為0～1.3%，與其他帶屬絳蟲同源基因的變異率大于8.6%，由此可見多頭蚴cox2基因片段的種內(nèi)變異遠小于種間變異，其中多頭帶絳蟲與牛帶絳蟲、亞洲帶絳蟲、豬帶絳蟲的相似性高于泡狀帶絳蟲、豆狀帶絳蟲、肥頭絳蟲和帶狀帶絳蟲，與Gasser等[10]報道的結果一致。

2.2 多頭蚴地理種群的遺傳多樣性對12個多頭蚴樣品的pcox2基因進行單倍型分析，共檢測出4個單倍型，即H1～H4，其中雅安樣品和攀枝花樣品共享單倍型H2，雅安僅有此單倍型。在4個單倍型出現(xiàn)頻率最高的是H2，占全部個體的50%。計算12個樣品的單倍型多樣性（Hd）為0.712，核苷酸多樣性（Pi）為0.00551，多態(tài)位點數(shù)8個，平均核苷酸差異（K）為2.924，遺傳距離為0.002～0.008（平均0.002），與已知多頭帶絳蟲的遺傳距離為0.017～0.032，與其他帶屬絳蟲的遺傳距離大于0.032。腦源、肌肉源種群內(nèi)單倍型間遺傳距離分別為0.002～0.008、0.000～0.004，攀枝花與雅安種群間遺傳距離為0.002。各種群的遺傳多樣性參數(shù)見表2。

衡量一個種群線粒體遺傳變異有兩個重要的指標：單倍型間的平均遺傳距離和核苷酸多樣性。一般而言，單倍型間的核苷酸多樣性（Pi）是衡量群體內(nèi)遺傳多樣性的重要指標之一。Pi值越大，表明群體的遺傳多樣性越豐富[11]。由于核苷酸多樣性考慮了各種單倍型在群體中所占的比例，因此反映一個群體的線粒體多態(tài)程度是比單純的平均遺傳距離更準確[12]。對于大多數(shù)動物來說，Pi值在0.01以上時被認為變異較大[13]。本研究結果顯示，多頭蚴單倍型間的pcox2序列Pi為0.00551，由此可見基于pcox2序列的多頭蚴各種群間的遺傳多樣性較低。

圖1 多頭蚴分離株cox2基因片段序列比對及核苷酸變異位點Fig.1 Sequences alignment of cox2 gene fragment and nucleotide variation sites of Coenurus isolates

表2 基于cox2基因序列的多頭蚴種群遺傳多樣性Table2 The genetic diversity based on cox2 gene in the populations of Coenurus

不同群體間的遺傳距離反映其群體間遺傳組成分化的程度。就cox2基因片段而言，攀枝花種群的分化程度（平均遺傳距離為0.004）高于雅安種群（平均遺傳距離為0）。且雅安樣品間cox2基因序列沒有任何變異，單倍型多樣性和核苷酸多樣性均為0，這可能是由于雅安種群的多頭蚴均采自一養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的同一群山羊體內(nèi)，而攀枝花種群的多頭蚴均采自不同養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的羊。另外，絳蟲是雌雄同體，可通過有性生殖階段的自體孤立、自體受精的生殖方式、株間不會雜交等機理維持其同種狀態(tài)（同株遺傳性）[14]，它們的后代基因可能完全一致。這個特征對絳蟲種群的基因結構具有非常重要的影響。如自體受精可能降低種群內(nèi)的基因變異，并增加種群間的分化[15]。

2.3 基于pcox2基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析構建的貝葉斯樹和NJ樹的拓撲結構基本一致（僅列出NJ樹，見圖2）。構建的NJ樹顯示12個測序株與多頭帶絳蟲已知株構成1個分支，能與豬帶絳蟲（T.solium）、牛帶絳蟲（T.saginata）、亞洲帶絳蟲（T.asiatica）、豆狀帶絳蟲（T.pisiformis）、泡狀帶絳蟲（T.hydatigena）、肥頭帶絳蟲（T.crassiceps）、帶狀帶絳蟲（T.taeniaeformis）很好地鑒別，且多頭帶絳蟲與豬帶絳蟲的親緣關系最近。

圖2 基于pcox2序列NJ法構建的多頭蚴系統(tǒng)發(fā)育樹（支持率標注在分支上）Fig.2 Phylogenetic tree of Coenurus based on pcox2 sequence by using neighbor-joining analysis ( Numbers on the tree represent the supporting value )

通常帶科絳蟲病的診斷常采用傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法和ELISA等免疫學診斷方法，但這些方法都有一定的缺陷。傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定需要采集完整的蟲體，并且對頭節(jié)和不同發(fā)育階段的節(jié)片進行固定、染色、封片等繁瑣的操作后觀察進行種類鑒定。而ELISA等免疫學診斷方法所用抗原局限于來源有限的天然抗原，且常因存在交叉抗原而假陽性高，在臨床應用中受到限制[16,17]。近年興起的分子方法對帶科絳蟲的鑒別、系統(tǒng)分類學、診斷、流行病學、傳播方式、種群分析、耐藥性研究和疫苗的發(fā)展都有非常重要的影響[18]。

目前用于多頭帶絳蟲的分子標記主要有cox1[19]、nad1[20]、nad4[21]、Cytb[22]、12S rRNA[23]等，但cox2基因能否作為研究多頭帶絳蟲分離株種內(nèi)變異的分子標記，目前國內(nèi)外均未見報道。本研究的結果顯示多頭蚴cox2基因種內(nèi)存在一定的遺傳差異，但相對保守，與帶屬其他絳蟲種間差異較大，故可作為多頭帶絳蟲種間遺傳變異研究的分子標記。

[1] 楊光友, 張志和.野生動物寄生蟲病學 [M].北京∶ 科學出版社, 2013∶ 386-389.

[2] Sharma D K, Chauhan P P S.Coenurosis status in Afro-Asian region∶ A review [J].Small Ruminant Res, 2006, 64(3)∶ 197-202.

[3] Scala A, Cancedda G M, Varcasia A, et al.A survey of Taenia multiceps coenurosis in Sardinian sheep [J].Vet Parasitol, 2007, 143(3-4)∶ 294-298.

[4] El-On J, Shelef I, Cagnano E, et al.Taenia multiceps∶ a rare human cestode infection in Israel [J].Vet Ital, 2008, 44(4)∶ 621-631.

[5] 李文卉, 付寶權.腦多頭蚴病研究進展 [J].動物醫(yī)學進展, 2010, 31(10)∶ 87-91.

[6] 范彥雷, 婁忠子, 李立, 等.絳蟲種的分類鑒定方法研究進展 [J].中國人獸共患病學報, 2014, 30(2)∶ 199-206.

[7] 郝桂英.線粒體基因在帶屬絳蟲分子分類中的研究進展[J].動物醫(yī)學進展, 2014, 35(1)∶ 94-98.

[8] 薩姆布魯克 J, 拉塞爾 D W.分子克隆實驗指南 [M].3版.黃培堂, 王嘉璽, 朱厚礎, 等譯.北京∶ 科學出版社, 2002.

[9] 賈萬忠, 閆鴻斌, 史萬貴, 等.帶屬絳蟲線粒體基因組全序列生物信息學分析 [J].中國獸醫(yī)學報, 2010, 30 (11)∶1480-1485.

[10] Gasser R B, Zhu X, McManus D P.NADH dehydrogensase subunit 1 and cytochrome c oxidase subunit Ⅰsequences compared for members of the genus Taenia (Cestoda) [J].Int J Parasitol, 1999, 29 (12)∶ 1965-1970.

[11] Smith M A, Woodley N E, Janzen D H, et al.DNA barcodes reveal cryptic host-specificity within the presumed polyphagous members of a genus of parasitoid flies [J].Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(10)∶ 3657-3662.

[12] 周慧, 李迪強, 張于光, 等.藏羚羊mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性研究 [J].遺傳, 2006, 28(3)∶ 299-305.

[13] Neigel J E, Avise J C.Application of random walk model to geographic distribution of animal mitochondrial DNA variation [J].Genetics, 1993, 135(4)∶ 1209-1220.

[14] Wachira T M, Bowels J, Zeyhle E, et al.Molecular examination of the sympatry and distribution of sheep and camel strains of Echinococcus granulosus in Kenya [J].Am J Trop Med Hyg, 1993, 48(4)∶ 473-479.

[15] Charlesworth B, Morgan M T, Charlesworth D.The effect of deleterious mutations on neutral molecular variation [J].Genetics Soc America, 1993, 134(4)∶ 1289-1303.

[16] 郭寶平, 張壯志, 張文寶, 等.用ELISA方法檢測原頭節(jié)及EgM免疫犬IgG變化情況 [J].地方病通報, 2007, 22(4)∶ 1-4.

[17] 王春仁, 于萬才, 仇建華, 等.斑點免疫金滲濾試驗檢測綿羊腦多頭蚴病的研究 [J].中國獸醫(yī)寄生蟲病, 2001, 9(1)∶ 12-14.

[18] Gasser R B.PCR-based technology in veterinary parasitology [J].Vet Parasitol, 1999, 84(3-4)∶ 229-258.

[19] Li W H, Jia W Z, Qu Z G, et al.Molecular characterization of Taenia multiceps isolates from Gansu province, China by sequencing of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 [J].Korean J Parasitol, 2013, 51(2)∶ 197-201.

[20] Varcasis A, Jia W Z, Yan H B, et al.Molecular characterization of subcutaneous and muscular coenurosis of goats in United Arab Emirates [J].Vet Parasitol, 2012, 190(3/4)∶ 604-607.

[21] 何德肆, 徐平源, 彭運潮.湖南省山羊腦多頭蚴的線粒體nad1和nad4基因的序列測定及種系發(fā)育分析 [J].畜牧獸醫(yī)學報, 2011, 42(12)∶ 1763-1767.

[22] 郝桂英, 楊應東, 周英姿, 等.基于線粒體cox1和Cyt b基因?qū)λ拇ǖ貐^(qū)多頭帶絳蟲的種群遺傳多樣性研究[J].畜牧獸醫(yī)學報, 2014, 45(4)∶ 631-638.

[23] Rostami S, Salavati R, Beech R N, et al.Cytochrome coxidase subunit 1 and 12S ribosomal RNA characterization of Coenurus cerebralis from sheep in Iran [J].Vet Parasitol, 2013, 197(1-2)∶ 141-151.

SEQUENCING AND PHYLOGENETIC ANALYSIS OF MITOCHONDRIAL COX2 GENE OF COENURUS IN GOATS IN SICHUAN PROVINCE

HAO Gui-ying1,2, YANG Ying-dong3, YANG Guang-you1
(1.College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Ya'an 625014, China; 2.Xichang College, Xichang 615013, China; 3.Animal Science and Fisheries Research Institute, Panzhihua Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Panzhihua 617061, China)

The mitochondrial cytochrome coxidase subunit 2 (cox2) gene was used as a molecular marker to identify the intraspecies variation and reconstruct their phylogenetic relationship of 12 Coenurus isolates collected from goats in Sichuan province.Sequence analysis indicated that the cox2 gene fragment was 531 bp containing a total of 8 nucleotide variant sites.The Phylogenetic tree based on the cox2 sequence showed that all Taeina multiceps isolates clustered together while cerebral and intramuscular specimens grouped together, indicating that all isolates were T.multiceps.There was no signifi cant variation in the cox2 gene sequences within Coenurus although interspecies differences were obvious in Taenia.Therefore, cox2 gene was suitable as a molecular marker to study the intraspecifi c variation of T.multiceps.The results of the present study paid a solid foundation for molecular diagnosis of coenurosis.

Coenurus; goats; cox2 gene; phylogenetic relationship

S852.734

：B

：1674-6422（2015）01-0054-06

2014-08-19

教育部長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃項目（IRT0848）

郝桂英，女，博士，主要從事分子寄生蟲學研究

楊光友，E-mail∶guangyou1963@aliyun.com