同源盒基因在裸鼠多發(fā)性骨髓瘤中的作用

李燕楊濤1張培軍2楊潔羅建民3郝洪嶺王素云李杰袁軍王瑞倉張曉霞王超

(河北省人民醫(yī)院血液科,河北石家莊050051)

摘要〔〕目的探討同源盒基因(HOX)B在多發(fā)性骨髓瘤(MM)中的作用。方法用免疫組化法、實時RT-PCR技術(shù)、TUNEL法對裸鼠組織細(xì)胞中的HOXB基因表達(dá)水平進行檢測，檢測結(jié)果經(jīng)過內(nèi)參基因β-actin校正后，按2-ΔΔCt法進行計算。得到各組HOXB相對表達(dá)量F值，以對照組為參照，HOXB mRNA相對表達(dá)率(%)=100%×(其他組mRNA相對表達(dá)量F值/對照組mRNA相對表達(dá)量F值)，計算各組HOXB3 mRNA、HOXB4 mRNA和HOXB7 mRNA相對表達(dá)水平。結(jié)果在造模實驗中，30只大鼠中死亡1只，造模失敗2只，27只納入觀察組。觀察組HOXB3、HOXB4 、HOXB7 mRNA相對表達(dá)水平均高于對照組(P<0.05)。而免疫組化法則發(fā)現(xiàn)觀察組的陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組。結(jié)論HOXB基因參與MM形成和發(fā)展，在其中扮演了較為重要的角色。

關(guān)鍵詞〔〕同源盒基金(HOX)B；多發(fā)性骨髓瘤；RT-PCR技術(shù)

中圖分類號〔〕R55〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

1河北省人民醫(yī)院泌尿外科2高碑店市醫(yī)院呼吸科

3河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科

第一作者：李燕(1978-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事惡性血液病研究。

同源盒基因(HOX)最初是在果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的，后來證實HOX基因存在于所有的動物種類中，而且其作用不僅僅是參與了胚胎發(fā)育，而且也參與了造血干細(xì)胞的自我更新及定向分化〔1〕，HOX家族編碼的蛋白質(zhì)是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，每個基因中含有同源結(jié)構(gòu)域，分別包括了一個核苷酸序列和若干個氨基酸。目前已經(jīng)被鑒定的人類HOX有39個，HOXB家族是由B1～B9及B13成員組成的。目前對HOXB3、HOXB4和HOXB7基因的研究均集中在其對造血干細(xì)胞的影響〔2，3〕及對免疫細(xì)胞的增生影響。本研究探討HOXB在鼠多發(fā)性骨髓瘤(MM)中的作用。

1材料與方法

1.1實驗材料30只實驗用裸鼠，均為雌性，6周齡，體重14～16 g，飼養(yǎng)于無菌間層流室內(nèi)，每籠5只，每3 d換1次飼料、飲水及墊料，采用MPC-11骨髓瘤細(xì)胞于BALB/c裸鼠皮下接種(接種濃度為6×105個腫瘤細(xì)胞)〔4〕，每鼠0.1 ml。30 d后，脫臼處死裸鼠，切其腹部，將其腫瘤部分分離出，分離出漿細(xì)胞待檢。造模成功大鼠27只歸入觀察組，選同類體重類似周齡相同的正常裸鼠27只歸入對照組。

1.2方法用免疫組化法、實時RT-PCR技術(shù)、TUNEL法比較兩組裸鼠腹部皮下組織細(xì)胞中HOXB基因表達(dá)水平。采用Primer 5引物軟件設(shè)計目的檢測物mRNA及內(nèi)參照基因β-actin的PCR引物，經(jīng)GeneBank Blast進行同源性比較，確定其特異性，將引物進行稀釋，在-20℃環(huán)境下進行保存，選擇MM細(xì)胞作為觀察點，將其用PBS沖洗2次后放入培養(yǎng)皿中，并且加入裂解細(xì)胞，室溫下放置5 min，直到細(xì)胞裂解液可以被吸取到EP管中為止，將其輕輕地進行顛倒混合，再放置2 min，然后加入配合好濃度的氯仿，并且用槍頭反復(fù)吹打幾次，靜置10 min。凝膠電泳檢測樣品見圖1。按照上述方法可以獲得RNA，經(jīng)檢驗符合實驗要求后，對其進行逆轉(zhuǎn)錄，將mRNA進行反轉(zhuǎn)錄，變成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄操作按照試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)操作說明。操作后可以得到的各個標(biāo)本基因的相關(guān)數(shù)據(jù)，細(xì)胞系HOXB mRNA相對表達(dá)量 = 2-ΔΔCt，其中ΔCt = Ct(PANC-1)-Ct(β-actin)。免疫組化方法是10%正常血清阻斷非特異性結(jié)合位點，室溫20 min；不洗，滴加適當(dāng)稀釋一抗，37℃ 2 h，PBS洗3×3 min；生物素化豬抗羊IgG 1∶200 37℃ 30 min；PBS洗3×3 min；Streptavidin-HRP 1∶200 37℃ 30 min；PBS洗3×3 min；0.05% DAB+0.03%H2O2顯色8～12 min，水洗；蘇木素襯染，水洗；吹干，樹膠封片；結(jié)果中陽性表達(dá)呈棕褐色，背景為青藍(lán)色。每張切片隨機觀察5個視野，每個視野計數(shù)500個細(xì)胞中出現(xiàn)的陽性細(xì)胞數(shù)，計算凋亡細(xì)胞指數(shù)(AI=TUNEL 染色陽性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞數(shù)×100%)。

1～4：為提取的RNA樣品 圖1　凝膠電泳檢測樣品

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行t及χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1造模結(jié)果以B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性漿細(xì)胞，能在半固體培養(yǎng)基上生長及使裸鼠生長腫瘤、腫瘤的病理檢測、小鼠血清免疫固定電泳等特征，利用影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)裸鼠體內(nèi)腫瘤長至長徑0.8 cm，判斷為造模成功。

2.2HOXB3、HOXB4、HOXB7基因表達(dá)水平在兩組中的比較觀察組HOXB3、HOXB4、HOXB7 mRNA相對表達(dá)水平均明顯高于對照組，見表1。

2.3兩組HOXB基因陽性表達(dá)情況觀察組組織細(xì)胞的各個階段可見陽性顆粒沉著于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)。見圖2。

表1　兩組HOXB3、HOXB4、HOXB7 mRNA

圖2　對照組及觀察組各個時間段HOXB基因表達(dá)情況(×400)

3討論

MM屬于惡性漿細(xì)胞病，其發(fā)病特征就是單克隆漿細(xì)胞惡性增殖，并且分泌了大量的單克隆免疫球蛋白，前者又引發(fā)了后者無序的增生，并且形成了浸潤的特征，大量單克隆免疫球蛋白出現(xiàn)，導(dǎo)致了蛋白分泌的抑制，破壞了骨質(zhì)，并且還會形成反復(fù)感染，貧血和高鈣血癥等，這一系列臨床表現(xiàn)導(dǎo)致了嚴(yán)重的不良后果，所以引起其發(fā)病因素還不是很明確，但是很多研究認(rèn)為其主要表達(dá)B細(xì)胞——漿細(xì)胞特點，所以其起源可能比起B(yǎng)細(xì)胞更早，有可能是造血前體細(xì)胞發(fā)生惡變而形成的。采用MPC-11骨髓瘤細(xì)胞于BABL /c小鼠皮下接種的方法，成功建立MM動物模型方法可靠〔4,5〕。

HOXB基因在造血調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，并且也參與了干細(xì)胞和免疫細(xì)胞增殖和凋亡的過程，其表達(dá)異常參與了各類血液疾病和惡性細(xì)胞腫瘤的發(fā)生。HOXD13突變會造成多指癥，HOXA13突變則會導(dǎo)致手腳生殖器征，HOXB群集中的8個成員會影響紅細(xì)胞的發(fā)育，其中HOXB4與HOXB7又會影響T細(xì)胞與B細(xì)胞。由此可知，該細(xì)胞基因可能與同樣因較前B細(xì)胞更早的造血前體細(xì)胞的惡變產(chǎn)生的MM有關(guān)。本研究提示HOXB基因參與MM形成和發(fā)展，在其中扮演了較重要的角色。HOXB基因表達(dá)水平對MM生物學(xué)行為的影響：首先，下調(diào)HOXB表達(dá)水平抑制干細(xì)胞和免疫細(xì)胞系的生長增殖能力，免疫細(xì)胞衰減及干細(xì)胞造血功能的損傷，使得各類腫瘤細(xì)胞無限制生長增殖。

但是本研究也同樣提出一系列未解決的問題，例如，即便了解了MM組織HOXB基因表達(dá)的異常性，如何對其進行靶向治療，誰是HOXB的靶基因。即便找到了靶基因，那么靶向性分布仍然不能保證100%進入腫瘤細(xì)胞，同樣不可避免地進入正常細(xì)胞并表達(dá)，對正常細(xì)胞構(gòu)成潛在的生物學(xué)威脅，影響正常細(xì)胞的增殖？這些問題都有待進一步研究。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-01-23修回〕

(編輯苑云杰)