雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1和趨化因子受體5表達(dá)的影響

蔣雯雯林榮韋登明尹向旭龍正海1

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江寧波315211)

摘要〔〕目的觀察雷公藤內(nèi)酯醇(TL)對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎(AIA)大鼠病變關(guān)節(jié)組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(FLT1)和趨化因子受體5(CCR5)表達(dá)的影響。方法在建立大鼠AIA模型基礎(chǔ)上，給予0.1～0.4 mg/kg TL治療后，測(cè)量病變關(guān)節(jié)腫脹度，常規(guī)HE染色觀察病變關(guān)節(jié)組織炎癥反應(yīng)；免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)病變關(guān)節(jié)組織VEGF、FLT1和CCR5蛋白的表達(dá)；分子原位雜交分析FLT1 mRNA含量。結(jié)果與模型組比較，不同劑量TL治療組關(guān)節(jié)腫脹度明顯減小(P<0.05)，病變關(guān)節(jié)組織的病理損害明顯改善；病變關(guān)節(jié)組織VEGF、FLT1和CCR5免疫陽性細(xì)胞顯著減少(P<0.05)； FLT1 mRNA表達(dá)含量明顯減少(P<0.05)。結(jié)論TL可抑制AIA大鼠病變關(guān)節(jié)組織VEGF、FLT1和CCR5表達(dá)，這可能是TL抑制病變關(guān)節(jié)組織血管增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)的分子機(jī)制。

關(guān)鍵詞〔〕雷公藤內(nèi)酯醇(TL)；佐劑性關(guān)節(jié)炎(AIA)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；趨化因子受體(CCR)5

中圖分類號(hào)〔〕R2〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：寧波市科技局社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目(2006C100059)；寧波大學(xué)學(xué)科項(xiàng)目(XKL141056；XKL14D2102)

通訊作者：韋登明(1963-)，男，博士，教授，主要從事雷公藤分子藥理學(xué)研究。

1浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校

第一作者：蔣雯雯(1968-)，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事關(guān)節(jié)炎病理實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究。

血管增生主要受血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)調(diào)控，VEGF及其受體(VEGFR)作用后可促進(jìn)血管增生，VEGF在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)病變關(guān)節(jié)組織內(nèi)表達(dá)增多，抑制VEGF表達(dá)對(duì)改善和治療關(guān)節(jié)炎有療效〔1，2〕。研究表明〔3〕，RA發(fā)病時(shí)關(guān)節(jié)滑膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)與趨化因子(CC)與趨化因子受體(CCR)5的相互作用有關(guān)。雷公藤治療RA療效顯著，研究表明〔4〕，雷公藤內(nèi)酯醇(TL)可減少關(guān)節(jié)炎病變組織中血管增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但其作用機(jī)制尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察TL對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎(AIA)大鼠病變關(guān)節(jié)組織VEGF、FLT1(VEGFR1)和CCR5表達(dá)的影響，探討該藥對(duì)關(guān)節(jié)炎滑膜組織血管增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)抑制作用的分子機(jī)制。

1材料和方法

1.1藥品、試劑和儀器TL(純度大于99.98%，批號(hào)：080718)購于上?？菩l(wèi)醫(yī)療技術(shù)研究所，用2%丙二醇溶解，終濃度為200 μg/ml，用真空過濾器和微孔濾膜進(jìn)行抽真空過濾除菌后4℃冰箱保存?zhèn)溆?。FLT1原位雜交試劑盒、兔抗大鼠VEGF、FLT1(VEGFR1)、CCR5多克隆抗體、生物素化羊抗兔IgG、SABC免疫組化試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。完全弗氏佐劑(FCA)購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，JD801形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)購于江蘇省捷達(dá)科技有限公司，PV-200型足趾容積測(cè)量?jī)x購于成都泰盟科技有限公司。

1.2AIA模型的建立將無水羊毛脂和滅活的卡介苗10 mg溶解于1 ml的液體石蠟中，配置成10 mg/ml FCA。用10%的水合氯醛按照3 ml/kg的劑量腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠后，于大鼠右后足趾皮內(nèi)注射0.1 ml的FCA，約2 w時(shí)間可以成功誘導(dǎo)AIA模型。空白對(duì)照組于相同部位注射等劑量的生理鹽水溶液進(jìn)行替代。

1.3動(dòng)物分組50只SD大鼠(合格證號(hào)0102008)，體重200～250 g，雌雄不限，購于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)科學(xué)動(dòng)物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為五組，空白對(duì)照組，模型組，低劑量治療組(0.1 mg/kg)，中劑量治療組(0.2 mg/kg)，高劑量治療組(0.4 mg/kg)。每組10只。

1.4給藥方法造模后第15天，治療組按照0.1、0.2和0.4 mg/kg劑量腹腔注射TL,每天1次,連續(xù)5 d；空白對(duì)照組及模型組動(dòng)物腹腔注射等容積的2%丙二醇溶液,每天1次,連續(xù)5 d。于實(shí)驗(yàn)的第21天處死所有大鼠，取大鼠右后足趾10%中性緩沖甲醛中固定，進(jìn)行VEGF、FLT1和CCR5免疫組織化學(xué)染色觀察和FLT1 mRNA分子原位雜交分析。

1.5檢測(cè)方法

1.5.1右足跖腫脹度檢測(cè)關(guān)節(jié)炎模型誘導(dǎo)前后采用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)定右后跖排水量，右后跖的腫脹度以致炎前后排水量(ml)差值代表。

1.5.2組織學(xué)觀察到TL治療結(jié)束的預(yù)定時(shí)間，處死動(dòng)物后提取各組動(dòng)物右后踝關(guān)節(jié)組織標(biāo)本,用10%中性福爾馬林液固定，再用15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣螯合劑脫鈣,常規(guī)石蠟包埋制片,HE染色鏡檢。

1.5.3VEGF、FLT1(VEGFR1)、CCR5免疫組織化學(xué)染色觀察采用武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的VEGF、FLT1(VEGFR1)、CCR5免疫組織化學(xué)染色試劑盒，按照說明書要求的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，用SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果在100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)8個(gè)視野，以陽性細(xì)胞總數(shù)的平均值代表。

1.5.4FLT1 mRNA原位雜交分析采用武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的FLT1 mRNA原位雜交試劑盒，按照說明書要求的實(shí)驗(yàn)步驟操作，進(jìn)行FLT1 mRNA原位雜交分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.10統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1TL對(duì)AIA大鼠右后跖關(guān)節(jié)腫脹度影響肉眼觀察空白對(duì)照大鼠右后足跖的基本不發(fā)生腫脹。模型組大鼠右后足跖腫脹度較空白對(duì)照明顯增加，經(jīng)TL治療后，低、中、高劑量治療組大鼠右后足跖腫脹度較模型組明顯減輕(P<0.05，P<0.01),見表1。

2.2TL對(duì)大鼠右后踝關(guān)節(jié)組織病理變化影響顯微鏡下見空白對(duì)照組未見右后踝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。模型組有較多淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)于關(guān)節(jié)滑膜組織，可見軟骨壞死缺損，有骨破壞。TL治療組則表現(xiàn)出明顯治療作用，在滑膜組織中浸潤(rùn)炎細(xì)胞明顯減少，軟骨組織未見破壞。

2.3TL對(duì)各組關(guān)節(jié)組織VEGF、FLT1、CCR5表達(dá)的影響空白對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)組織見僅有少量VEGF、FLT1和CCR5陽性細(xì)胞，細(xì)胞胞質(zhì)呈棕色陽性著色，且陽性細(xì)胞的分布區(qū)域不規(guī)則，多為散在的零星分布。模型組大鼠關(guān)節(jié)組織細(xì)胞中見大量VEGF、FLT1和CCR5陽性細(xì)胞，VEGF陽性細(xì)胞主要分布于滑膜細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面或者胞質(zhì)內(nèi)。FLT1和CCR5陽性細(xì)胞主要分布于滑膜細(xì)胞。在使用不同劑量的TL治療后，治療組大鼠關(guān)節(jié)組織滑膜細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF、FLT1和CCR5免疫染色陽性細(xì)胞表達(dá)個(gè)數(shù)較關(guān)節(jié)炎模型組明顯減少(P<0.05)。見表1。

2.4TL對(duì)各組關(guān)節(jié)組織FLT1 mRNA表達(dá)的影響鏡下發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中FLT1 mRNA陽性表達(dá)細(xì)胞量非常少，F(xiàn)LT1 mRNA的陽性信號(hào)定位于核內(nèi)。模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞中見大量FLT1 mRNA陽性細(xì)胞，與模型組大鼠比較，TL不同治療組大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞FLT1 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05 ,P<0.01)。見表1。

表1　TL對(duì)各組大鼠右后足跖腫脹、關(guān)節(jié)組織VEGF、FLT1 、CCR5和FLT1 mRNA表達(dá)變化的影響

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3討論

RA的基本病理特點(diǎn)是慢性滑膜炎、血管翳形成、軟骨及骨組織的侵蝕和破壞。VEGF是促進(jìn)血管新生的特異性細(xì)胞因子〔5～8〕。在RA發(fā)病過程中，血管新生發(fā)揮重要作用，VEGF通過(KDR/flk-1)途徑在RA中發(fā)揮重要作用，還可通過直接或間接作用于TNF-α和IL-1β的跨膜結(jié)構(gòu)域，在RA引起骨骼的溶解破壞起促進(jìn)作用〔9〕，并導(dǎo)致血管翳的形成。VEGF家族及其受體(VEGFRs)的相互作用是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎血管翳形成、軟骨及骨組織的侵蝕和破壞的重要分子機(jī)制〔10〕。

VEGF與酪氨酸激酶受體VEGFR1(也稱為受體FLT1)和VEGFR2(也稱為KDR/flk-1)的結(jié)合而發(fā)揮是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用〔11，12〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組中滑膜組織細(xì)胞有少量的VEGF表達(dá)，模型組中VEGF表達(dá)明顯增高，免疫組化的結(jié)果進(jìn)一步印證VEGF在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起重要作用，提示TL對(duì)AIA滑膜組織細(xì)胞的VEGF表達(dá)具有抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)免疫組化染色結(jié)果提示TL對(duì)AIA滑膜組織細(xì)胞的FLT-1表達(dá)具有抑制作用，TL對(duì)AIA滑膜組織細(xì)胞的VEGF mRNA表達(dá)具有抑制作用。本文認(rèn)為TL通過抑制FLT mRNA的表達(dá)，進(jìn)而減少FLT蛋白的生成。

RA主要的病理變化是關(guān)節(jié)滑膜出現(xiàn)大量的淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)。RA發(fā)病時(shí)滑膜上炎細(xì)胞浸潤(rùn)與CC、CXC亞族趨化因子(CHK)及其受體的相互作用有關(guān)。趨化因子受體CCR5在RA中的作用受到廣泛關(guān)注〔13〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CCR5的高表達(dá)與關(guān)節(jié)滑膜組織見大量淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)，TL對(duì)AIA滑膜組織細(xì)胞的CCR5表達(dá)具有抑制作用；組織病理變化結(jié)果也顯示經(jīng)TL治療后，治療組滑膜組織內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。因此，我們認(rèn)為，TL通過抑制關(guān)節(jié)炎滑膜組織細(xì)胞的CCR5表達(dá)而產(chǎn)生減少關(guān)節(jié)滑膜上大量的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)的作用，進(jìn)而抑制關(guān)節(jié)滑膜組織的損傷和破壞。TL可抑制AIA大鼠病變關(guān)節(jié)組織VEGF、FLT1和CCR5表達(dá)，這可能是TL抑制病變關(guān)節(jié)組織血管增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)的分子機(jī)制。

4參考文獻(xiàn)

1Melinte R，Jung I，Georgescu L，etal.VEGF and CD31 expression in arthritic synovium and cartilage of human knee joints〔J〕.Rom J Morphol Embryol，2012;53(4):911-5.

2Oranskiy SP，Yeliseyeva LN，Tsanaeva AV，etal.Body composition and serum levels of adiponectin，vascular endothelial growth factor，and interleukin-6 in patients with rheumatoid arthritis〔J〕.Croat Med J，2012；53(4):350-6.

3White GE，Iqbal AJ，Greaves DR，etal.CC chemokine receptors and chronic inflammation-therapeutic opportunities and pharmacological challenges〔J〕.Pharmacol Rev，2013；65(1):47-89.

4莫淡雅,劉春芳,林娜.雷公藤甲素對(duì)膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠骨與關(guān)節(jié)的影響〔J〕.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2009；16(11)：403-9.

5任海霞,肖誠(chéng),李梢,等.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的血管生成相關(guān)因子研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2007;13(4):315-8.

6儲(chǔ)永良,黃清春.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性〔J〕.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2005；9(6)：359-62.

7王立丹,余成新.VEGF在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血管生成中的作用及其研究進(jìn)展〔J〕.山東醫(yī)藥，2008;48(20)：99-101.

8Ng YS，Krilleke D，Shima DT.VEGF function in vascular pathogenesis〔J〕.Exp Cell Res，2006;312(5):527-37.

9Han SW，Kim GW，Seo JS，etal.VEGF gene polymorphisms and susceptibility to rheumatoid arthritis〔J〕.Rheumatology，2004;43(9):1173-7.

10Klimiuk PA，Sierakowski S，F(xiàn)iedorczyk M，etal.Serum tumor necrosis factor alpha (TNF- alpha) concentration correlates with soluble adhesion molecules and vascular endothelial growth factor (VEGF) in rheumatoid arthritis〔J〕.Przegl Lek，2004;61(2):86-9.

11Choi HM，Lee YA，Lee SH,etal.Adiponectin may contribute to synovitis and joint destruction in rheumatoid arthritis by stimulating vascular endothelial growth factor，matrix metalloproteinase-1，and matrix metalloproteinase-13 expression in fibroblast-like synoviocytes more than proinflammatory mediators〔J〕.Arthrit Res Ther，2009;11(6):161-71.

12Shibuya M，Claesson-Welsh L.Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymph angiogenesis〔J〕.Exp Cell Res，2006;312(5):549-60.

13吳孔田,張英起,顏真,等.趨化因子受體CCR5胞外段重組蛋白的克隆、表達(dá)、純化及鑒定〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006；27(5):412-5.

〔2013-12-08修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)