siRNA 沉默Bmi-1表達對肺腺癌A549細胞侵襲能力的影響

劉丹丹鄭翔宇1，2劉奔劉純青1王藝芳1趙寶霞1孟秀香1

(大連醫(yī)科大學診斷學實驗中心，遼寧大連116044)

摘要〔〕目的觀察Bmi-1基因沉默對A549細胞增殖和侵襲影響并初步探討其機制。方法根據(jù)四條針對Bmi-1的小干擾RNA(siRNA)序列，將其瞬時轉(zhuǎn)染到A549細胞中，選擇最有效的一條鏈并構(gòu)建到逆轉(zhuǎn)錄病毒真核表達載體pSUPERretro-Neo中，形成重組載體，然后將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至A549細胞中，構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Bmi-1-shRNA的A549細胞。應(yīng)用MTT實驗檢測Bmi-1-siRNA對A549細胞體外增殖的影響；Transwell小室觀察其對A549侵襲能力的影響；RT-PCR和明膠酶譜法分別觀察siRNA對A549細胞MMP-2/MMP-9表達及活性的影響。結(jié)果Bmi-1 siRNA能夠抑制A549細胞的增殖能力和侵襲能力，Bmi-1 siRNA能夠抑制A549細胞MMP-2/MMP-9的表達和活性。結(jié)論Bmi-1 siRNA對A549細胞侵襲能力的抑制和MMP-2/MMP-9的活性降低有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕肺腺癌；siRNA；Bmi-1基因；侵襲

中圖分類號〔〕R734〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：遼寧省自然科學

通訊作者：孟秀香(1965-)，女，教授，博士，碩士生導師，主要從事腫瘤細胞生物學研究。

1大連醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院2河南省中醫(yī)院檢驗科

第一作者：劉丹丹(1964-)，女，實驗師，主要從事腫瘤細胞生物學研究。

目前對肺腺癌發(fā)生發(fā)展確切機制的了解仍較為貧乏，因此研究肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制具有重要的臨床意義。Bmi-1最初作為原癌基因被Van Lohuizen等人〔1〕發(fā)現(xiàn)，Bmi-1與c-myc基因協(xié)同使得B淋巴細胞發(fā)生改變從而導致了鼠淋巴白血病〔2〕。近年研究表明，Bmi-1基因在人類一些常見的惡性腫瘤如鼻咽癌、乳腺癌、大腸癌、胃癌等腫瘤中都存在高表達情況〔3～6〕，與腫瘤的增殖和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有關(guān)Bmi-1在肺癌中的表達已有報道，非小細胞肺癌(NSCLC)中Bmi-1表達較正常肺組織相比明顯增高〔7〕。并且Bmi-1在肺癌的晚期較肺癌早期表達明顯增高〔8〕，這說明Bmi-1參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展機制。以往研究中，針對Bmi-1基因設(shè)計4對發(fā)夾式Bmi-1 siRNA質(zhì)粒，均能抑制子宮頸癌Hela細胞的體內(nèi)外增殖能力〔9〕。本文研究沉默Bmi-1基因的表達對A549細胞遷移和侵襲的影響。

1材料和方法

1.1細胞培養(yǎng)A549細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。未轉(zhuǎn)染的細胞命名為A549-wt，轉(zhuǎn)染PSUPER-retro-neo-Bmi-1和自由序列的分別命名為A549-siRNA-Bmi-1和A549-ctr。

1.2RT-PCR總RNA用Trizol試劑提取，然后按照TaKaRa的RT-PCR試劑盒說明書進行操作。MMP-2基因上游引物：5′-TGGCAGTGCAATACCTGAAC-3′，MMP-2基因下游引物：5′-CCGTACTTGCCATCCTTCTC-3′；MMP-9基因上游引物：5′-AGTGGCACCACCACA ACA T-3′，MMP-9基因下游引物：5′-TCCTGGGTGTAGAGTCTCTCG-3′；GAPDH上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，GAPDH下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。擴增產(chǎn)物在含0.5%溴乙啶的1%瓊脂糖凝膠電泳中分離。

1.3四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)法檢測細胞增殖能力取對數(shù)生長期的三組細胞消化后按每孔細胞數(shù)為2×103單細胞懸液接種于96孔板中，設(shè)5個復孔，1 d后各組分別取5孔進行實驗，連續(xù)測5 d。檢測時每孔加入MTT 10 μl，4 h后小心吸去孔內(nèi)的液體，加入150 μl DMSO，震蕩15 min，使結(jié)晶物完全溶解，酶標儀490 nm測定吸光度。

1.4細胞侵襲試驗按照BD BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber試劑盒說明書要求進行操作。大致如下：將無血清培養(yǎng)基加入小室，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)2 h。除去培養(yǎng)基，加入濃度為1×105/ml的細胞懸液0.5 ml(無血清)。下室加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基0.75 ml。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)48 h。用棉簽將殘留在上室內(nèi)表面的細胞拭去。用10%甲醛固定遷移至小室外表面的細胞，0.25%結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下計數(shù)細胞，取5個視野(×400)細胞計數(shù)的平均值。

1.5明膠酶譜分析取等量的三組細胞接種在6孔板上，待80%融合時換無血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h收集上清液。1 000 r/min離心5 min，分裝，-80℃保存。制膠結(jié)束后(分離膠含0.1%明膠的)，自冰箱中拿出細胞上清液，加入無β-巰基乙醇的5×上樣緩沖液后進行上樣、電泳。取出PAGE膠，在含2.5%TritonX-100洗脫液震蕩洗滌15 min×4次，加入明膠酶緩沖液，37℃孵育48 h。再進行脫色直至出現(xiàn)清晰條帶。凝膠成像，圖像分析軟件進行定量分析。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行方差分析。

2結(jié)果

2.1Bmi-1 siRNA抑制A549細胞的體外增殖能力MTT法檢測A549細胞每天的吸光度值，A549 Bmi-1 siRNA細胞在第三天及以后的時間OD值明顯低于A549-ctr 和A549-wt兩組細胞，生長速度明顯受到抑制(P<0.05)；而后兩組細胞的生長數(shù)值在統(tǒng)計學上無差異(P>0.05)。見表1。

表1　沉默Bmi-1基因?qū)549細胞體外增值能力的

與A549-siRNA-Bmi-1比較：1)P<0.05

2.2Bmi-1 siRNA抑制A549細胞的侵襲能力Transwell方法檢測沉默Bmi-1基因后對A549細胞侵襲能力的影響，A549-Bmi-1-siRNA細胞組的侵襲能力顯著低于A549-wt和A549-ctr細胞組(P<0.01),而A549-wt和A549-ctr細胞組之間無顯著性差異(P>0.05)。見圖1。

圖1　沉默Bmi-1基因?qū)549細胞侵襲能力的影響(×400)

2.3沉默Bmi-1表達對MMP-2/MMP-9表達及活性的影響

2.3.1RT-PCR檢測三組細胞中MMP-2和MMP-9 mRNA表達結(jié)果A549-Bmi-1-siRNA細胞MMP-2、MMP-9 mRNA的表達比A549-wt和A549-ctr細胞中MMP-2、MMP-9表達明顯降低(P<0.05)。見圖2。

2.3.2明膠酶譜法檢測沉默Bmi-1基因后對MMP-2和MMP-9活性的影響如圖3所示，A549-Bmi-1 siRNA細胞組MMP-2

圖2　RFT-PCR檢測各組細胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達

圖3　沉默Bmi-1基因?qū)549細胞MMP-2/MMP-9 活性的影響

(active形式)和MMP-9(active形式)顯著低于A549-wt和A549-ctr細胞組(P<0.05)，而A549-wt和A549-ctr細胞組酶譜分析結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。

3討論

本文結(jié)果表明沉默Bmi-1基因能夠減弱A549細胞的體外增殖能力侵襲是惡性腫瘤也是最重要的惡性生物學特征。腫瘤細胞通過細胞膜表面特定的受體與細胞外基質(zhì)或基底膜中的層黏連蛋白、Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白的黏附在一起，然后通過釋放一些蛋白水解酶類或激活基質(zhì)中已經(jīng)存在的酶原來促使基質(zhì)成分發(fā)生降解，癌細胞才得以遷移至被水解的基質(zhì)空隙中，通過這一方式癌細胞不斷向基質(zhì)深層侵襲，為下一步的轉(zhuǎn)移打下了基礎(chǔ)。鋪有人工基底膜Transwell小室是目前檢測癌細胞體外侵襲能力的簡單而有效的方法。Transwell小室實驗中采用的基質(zhì)膠Matrigel是從EHS小鼠腫瘤中提取的基質(zhì)成分，富含層黏連蛋白以及Ⅳ型膠原等成分。將基質(zhì)膠Matrigel鋪在侵襲小室的多孔濾膜上，能夠形成和天然基底膜非常類似的基底膜結(jié)構(gòu)，可以模擬體內(nèi)的基質(zhì)狀況。小室下方的血清濃度高于上方，所以，具有侵襲能力的細胞就會朝向高血清濃度方向趨動，穿過人工基底膜和直徑為 8 pm的聚碳酸微孔濾膜。本研究發(fā)現(xiàn)干擾組A549細胞成功穿過Matrigel膜和小室濾膜的細胞數(shù)較兩個對照組明顯減少，說明轉(zhuǎn)染Bmi-1-shRNA能夠使肺腺癌細胞侵襲能力明顯降低。

Liotta等〔10〕提出侵襲轉(zhuǎn)移三步學說：即黏附、降解和移動。其中血管基底膜的降解、破壞是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要步驟，基質(zhì)膜是機體阻礙癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要屏障。當癌細胞脫離原發(fā)灶遷移到細胞外基質(zhì)時，癌細胞能夠通過分泌多種蛋白水解酶來降解細胞外基質(zhì)，將基底膜這個阻礙癌細胞侵襲的屏障破壞。癌細胞從血管基底膜的破損處移出進入到血管中，進行血道轉(zhuǎn)移。從中不難看出，腫瘤細胞侵襲能力是其進行轉(zhuǎn)移的必需前提，因而非常重要。而達到侵襲目的的前提是其能分泌一些蛋白酶來降解細胞外基質(zhì)。能降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶包括四種，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是所有蛋白酶中最重要的一種。在癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的這一復雜過程中，MMPs起著非常重要的作用，是一類依賴鋅離子的細胞外蛋白水解酶，可降解細胞外基質(zhì)，能促進惡性腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔11，12〕。根據(jù)其作用底物的類型不同，可將金屬蛋白酶分為五大類，即膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解酶、巨噬細胞彈性蛋白酶、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶。這些酶的主要功能是降解各種類型的膠原、明膠蛋白、纖連蛋白、層連蛋白等細胞外基質(zhì)成分。在這些酶中，最為重要同時研究比較清楚的是明膠酶MMP-9和MMP-2〔13〕，二者可以催化水解細胞間基質(zhì)成分，降解基膜的主要成分膠原，促進腫瘤細胞向周圍正常組織浸潤〔14〕。Suzuki等〔15〕發(fā)現(xiàn)在NSCLC中的MMP-2和MMP-9均有高表達，且MMP-2的表達明顯強于MMP-9，故認為MMP-2在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮比MMP-9更加重要的作用。本實驗結(jié)果顯示高侵襲肺腺癌細胞株A549中，MMP-2的表達及活性也確實高于MMP-9。Bmi-1與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但它與MMPs是否有關(guān)及其介導通路尚未見報道。本研究結(jié)果表明，Bmi-1-shRNA抑制了A549細胞MMP-2/MMP-9 mRNA表達及MMP-2/MMP-9的活性，Bmi-1與肺腺癌的侵襲特性密切相關(guān)。

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〔2014-03-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)